[发明专利]用于冠心病诊断的血管过氧化物酶ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及血管过氧化物酶(VPO1)蛋白及抗体，特别涉及用于冠心病诊断的包含VPO1蛋白及抗体ELISA试剂盒。

背景技术

冠心病是严重危害人类健康的常见病，在我国冠心病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，心肌梗死已成为我国病人主要死因之一，且其发病出现明显低龄化趋势。动脉粥样硬化是冠心病的病理生理基础，其发病机制复杂，涉及氧化应激、脂质代谢紊乱，炎症反应等，其中脂质过氧化是近来的研究热点。

髓过氧化物酶(MPO)存在于中性粒细胞和单核巨噬细胞中，MPO可以氧化低密度脂蛋白(LDL)成为氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，是目前已知的一种催化脂质过氧化的重要酶类。临床研究表明，血液和单核细胞中的MPO水平与急性冠脉综合征的发生以及胸痛存在明显的正相关，目前，MPO已成为动脉粥样硬化内皮功能不全及急性冠脉综合征预后的一个重要的预测因子。血管过氧化物酶(VPO)是一种新的过氧化物酶，其与MPO在结构上有44.5％的同一性。VPO存在两种形式，其中VPO1主要在人体的心脏和血管中表达。

发明内容

本发明旨在通过对VPO1的进一步研究，提供一种VPO1融合蛋白，以及抗人VPO1多克隆抗体，并在此基础上提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速的定量检测人血清、血浆、脑脊液或其他人组织匀浆中的血管过氧化物酶浓度的ELISA试剂盒，用于冠心病临床诊断。

为实现上述发明目的，本发明的详细技术方案为：以含VPO1基因(NCBI的geneID：69675)的质粒为模板，根据原核表达载体pEGX-4T-2的GST阅读框架设计引物，使VPO1基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致，并使引物带有SalI和NotI酶切位点，进行PCR扩增，切胶后，经凝胶回收线性的4.9kb的VPO1编码区片段；用所述PCR回收产物及pEGX-4T-2载体进行SalI和NotI双酶切，产生匹配的粘末端，之后将pEGX-4T-2载体与VPO1基因连接，构建成符合阅读框的GST-VPO1融合基因；用含融合基因的pEGX-4T-2-VPO1质粒转化大肠杆菌BL21，挑选阳性菌落，提取纯化获得重组融合蛋白。

以上述VPO1融合蛋白免疫温血动物后，制备出抗人VPO1多克隆抗体。

一种血管过氧化物酶ELISA试剂盒，包括样品稀释液、酶底物显色液、浓缩洗涤液、封闭液和终止反应液，还包括上述VPO1融合蛋白、上述的抗人VPO1抗体包被的酶标板，以及酶标记二抗。

发明人首次在冠心病患者血清中发现VPO1的表达升高，同时在体外实验中证实VPO1可以氧化LDL成为ox-LDL，从而促进动脉粥样硬化的形成。VPO1与MPO相似，具备作为冠心病诊断和治疗的生化标记物的特点。在此基础上，本发明用生物工程方法制备出VPO1融合蛋白及抗人VPO1抗体，并建立ELISA试剂盒，用ELISA方法直接测定样品中的VPO1含量，用于冠心病的风险筛查和诊断。该试剂盒检测灵敏度小于5.0ng/ml，剂量-反应曲线的线性相关系数＞0.980，具有简便、快捷、灵敏、准确的优点，为体外诊断定量检测血管过氧化物酶提供了有效的手段。

附图说明

图1是VPO1融合蛋白的诱导表达的电泳图；

图2是VPO1融合蛋白提取纯化的电泳图；

图3是VPO1剂量(浓度)-反应(吸光度)曲线。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1：血管过氧化物酶ELISA试剂盒的制备

1.VPO1标准品的制备