[发明专利]一种微乳液克隆扩增结合水凝胶微球芯片数字化检测微突变的方法

权利要求书

1.一种检测微突变的方法，其特征在于该方法是采用微球介导的微乳液克隆扩增技术结合水凝胶芯片固定微球荧光检测及数字化分析技术进行微突变检测的方法。

2.根据权利要求1所述的检测微突变的方法，其特征在于微球介导的微乳液克隆扩增技术是将片段化的DNA模板、表面固定有扩增引物的微球以及PCR反应体系的混合物分散并包裹在油包水的微乳液微囊中同时并列进行微乳液PCR扩增，微乳液PCR扩增后，破乳，收集微球，将微球上扩增出的双链目的片段制备成单链DNA扩增片段；

其中：

每个微囊最多仅包含一个片段化的DNA模板分子、一个微球和PCR反应体系的混合物；

每个微球表面只固定一种扩增引物，固定的扩增引物是与片段化的DNA模板对应的一种基因特异性引物或者是与片段化的DNA模板对应的用于PCR扩增的一种公用引物；

PCR反应体系中的扩增引物含有与微球表面固定的扩增引物成对的引物；

片段化的DNA模板是指将DNA模板打断成小片段直接使用或者连接加尾。

3.根据权利要求2所述的检测微突变的方法，其特征在于连接加尾的片段化的DNA模板是以样本DNA分子为模板，进行多重连接依赖式探针扩增连接，连接后的产物即为片段化的DNA模板；每个突变位点使用三条MLPA的探针，分别为一条左探针和两条右探针；左探针包含两部分：一是与微球结合的公用引物相同的序列，二是一段与模板突变位点左侧适当长度的基因互补的特异性序列；两条右探针均包含三部分：一端是与微球结合的公用引物成对的引物互补的序列，中间是与不同荧光探针杂交的特异性序列，另一端是一段与模板突变位点及突变位点右侧适当长度的基因互补的特异性序列；两条右探针分别对应了微突变的一个等位特异性位点以及分别对应包含了一段特异性序列用于与一种荧光探针互补杂交。

4.根据权利要求2所述的检测微突变的方法，其特征在于表面固定有扩增引物的微球是将3’端NH₂修饰的一种扩增引物固定在NHS-琼脂糖微球表面而得到。

5.根据权利要求2所述的检测微突变的方法，其特征在于每个微囊最多仅包含一个片段化的DNA模板分子、一个微球和PCR反应体系的混合物是通过下列方法实现的：

将225μl Mock溶液与375μl油相于5ml的容器中混合并用磁力搅拌子在磁力搅拌器上以转速1000rpm搅拌5min，可见溶液呈微乳状，再加入200μl PCR混合物，继续在磁力搅拌器上以转速1000rpm搅拌5min形成均匀的油包水的微乳液；

其中，Mock溶液的组成为1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.1％BSA；油相的组成按为40％(w/w)DC 5225C配方助剂，30％(w/w)DC 749流体和30％(w/w)Ar20硅油；PCR混合物包含片段化的DNA模板，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.5mM dNTP混合物，0.1U/μl Taq DNA聚合酶，0.06μM的正向引物，0.6μM的反向引物，0.1％BSA，0.01％Tween-80以及表面固定有正向引物的微球，微球的数量与DNA模板拷贝数的比例在10∶1到1∶1之间，DNA模板的最大量为10⁷数量级。

6.根据权利要求2所述的检测微突变的方法，其特征在于油包水的微乳液在PCR过程中需保持微乳液的状态不变，不会因为温度的变化而引起破乳；所用到的油相为40％(w/w)DC 5225C配方助剂，30％(w/w)DC 749流体和30％(w/w)Ar20硅油，所用到的油水相体积比在3∶5到5∶5之间。

7.根据权利要求2所述的检测微突变的方法，其特征在于破乳的方法是指将扩增后的微乳液与异丙醇混合后，注入装有微孔滤膜的滤器，在滤膜上截留微球，将微乳液过滤除去；将微球上扩增出的双链目的片段制备成单链DNA扩增片段是将微球上扩增出的双链产物碱变性解链后吸去含游离的另一条单链DNA的碱液，收集固定有单链DNA扩增片段的微球。