[发明专利]α干扰素类似物的蛋白制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及α干扰素类似物作为抗肿瘤蛋白的制备方法，主要涉及生物技术领域。

背景技术

肿瘤的传统治疗分为三大类，即外科手术，放射疗法和化学疗法，前两种方法只对局限性肿瘤有效，对已经扩散的肿瘤则无法实施；化学疗法可以治疗肿瘤已经扩散的病人，但其毒副作用非常严重。近年来，在抗肿瘤药物的研究中，生物治疗药物异军突起，其作用针对性强、疗效好、不良反应较小，生物制剂研究已成为人们关注的焦点，并被认为是治疗肿瘤最有希望的方法，而其中干扰素是应用比较多的生物治疗药物。

干扰素的生物学活性可以归纳为三个方面，即抗病毒、抗肿瘤和免疫调节。由于干扰素具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的生物活性，已经广泛应用于临床。1986年美国食品药品管理局(FDA)首次批准rhIFNα-2α、rhIFNα-2b临床用于治疗毛细胞白血病、慢性髓性白血病、乙型肝炎、丙型肝炎等疾病。1990、1993年IFN-β、IFN-y继IFN-α系列后相继上市，用于复发-缓解型多发性硬化症、慢性肉芽肿等的治疗。随着生物技术的发展，极大地促进了干扰素医药产品的生产和研发。继大肠杆菌表达的干扰素系列后，CHO细胞、酵母等不同表达系统制备的干扰素相继问世，并应用于临床。随着干扰素的广泛应用，人们发现干扰素作为抗肿瘤药物在临床上也存在着小剂量疗效不够好、加大剂量副作用大等缺点，而且抗瘤谱比较窄，如对血液系统肿瘤有效而实体瘤效果比较差。为了提高干扰素疗效、降低副反应，人们开始对干扰素进行各种改进，新型干扰素不断问世。我们研制的新型α干扰素类似物(又称重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白，英文名称：Novaferon)，是采用基因穿梭法，将12种人α干扰素基因通过酶切等方法产生切点不同、长短不一的核苷酸小片段，再将这些小片段混合，经多轮PCR扩增，不同分子的同源片段就会互相替换，随机组合，从而得到大量的同源基因分子间相互杂交的新分子；采用高通量筛选技术，对十多万个克隆株进行抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性鉴定，成功筛选出了高活性新型α干扰素类似蛋白(Novaferon)。该技术核心点是：同源片段随机组合，并进行大规模的功能筛选，以数量取胜。采用这一技术对人α干扰素进行改造，至今尚属首创。该高活性新型蛋白Novaferon，由498个核苷酸编码166个氨基酸组成，理论分子量为19314.28道尔顿。分子内含4个半胱氨酸，形成两对二硫键，无糖基化，等电点约为6.60.该蛋白与人rhIFN-α14在碱基和氨基酸序列上同源性分别为89％(445/498)和81％(135/166)。初步体外实验表明，该重组蛋白Novaferon对Daudi细胞的生长抑制作用是rhIFNα-2b的200-400倍；在WISH-VSV系统上，其抗病毒比活性是rhIFNα-2b的10倍以上。

目前采用的纯化方法虽然可以达到较高的纯度，但是活性总收率较低，另外，培养基中的碳/氮比影响蛋白表达形成的形式，过高碳/氮比会使蛋白表达量下降，过低的碳/氮比会使表达的目标蛋白形成不溶形式，而不可溶的蛋白以包含体的形式存在，不具有生物活性，因此需要通过蛋白复性工艺，而干扰素类似物蛋白含有二对二硫键，势必使复性工艺复杂及成本增加。为了可以适用大规模的生产，提高蛋白的可溶性表达和增加活性蛋白的总收率成为急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，可以提高有生物活性蛋白的收率，增加可溶性蛋白的表达量，省去蛋白复性的工艺。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，包括步骤：

(1)将编码α干扰素类似物蛋白的基因克隆到表达载体后所形成的重组质粒转化到宿主菌中构建成工程菌，再将所述工程菌进行发酵培养，所述编码α干扰素类似物蛋白的基因的核甘酸序列为SEQ IDNO 1或者与SEQ ID NO 1的同源性不小于93％的核苷酸序列；

(2)诱导所述发酵培养的工程菌表达目标蛋白；

(3)纯化目标蛋白，所述纯化步骤为破碎经诱导的工程菌、离心破碎后菌体、稀释上清液、层析和收集含目标蛋白的样品。

步骤(1)中的同源性是指多个序列之间的相似程度，在本发明中也可以称为相同性。

所述表达载体可以是真核表达载体或者原核表达载体等，优选原核表达载体pBVB，采用原核表达载体时的宿主菌株可以为大肠杆菌DH5α或者大肠杆菌BL21。