[发明专利]利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法，属于组织工程人工角膜内皮技术。

背景技术

人角膜内皮在维持角膜厚度、透明度及为角膜提供养分等方面具有至关重要的作用。当角膜受到感染或手术创伤后，角膜内皮细胞便发生不同程度的减少，一旦角膜内皮细胞的密度低于形成完整角膜内皮层和维持角膜内皮生理功能的临界密度后，角膜内皮将出现不可逆病变，即角膜内皮盲。据不完全统计，我国目前约有角膜内皮盲患者80余万人，绝大多数患者可以通过角膜移植来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者得不到角膜移植而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起为组织工程人工角膜内皮的体外重建及其临床应用创造了条件，也为角膜内皮盲患者通过组织工程人工角膜内皮的移植和重见光明带来了新的希望。

对组织工程人工角膜内皮的体外重建研究开始于1990年初，如何获得足量的人角膜内皮细胞和理想的载体支架是目前组织工程人工角膜内皮体外重建研究的热点。国内外学者们分别利用癌基因转染的永生化人角膜内皮细胞、原代培养的人角膜内皮细胞或体外培养至第4-5代的人角膜内皮细胞作为种子细胞，分别利用角膜后弹力层、去上皮层羊膜、胶原-壳聚糖共混膜、聚羟乙基丙烯酸甲酯、无细胞猪角膜基质和N-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物等作为载体支架，在体外成功重建出形态、透明度和组织结构与正常角膜内皮近似的人角膜内皮组织类似物，为组织工程人工角膜内皮的体外重建开辟了道路，但由于所用种子细胞或者是转染了癌基因的永生化细胞或者是来自眼库角膜的原代培养细胞或者是在24孔培养板中仅传4-5代的细胞，由于种子细胞具有潜在致瘤性或数量极其有限，因而限制了组织工程人工角膜内皮的规模化体外重建及其临床应用。现有组织工程人工角膜内皮体外重建的研究报道，仍局限于实验研究，根本无法满足我国80余万、全世界1000余万角膜内皮盲患者临床移植的大量需要。

2005年，樊廷俊等首次成功建立了国际上唯一1个没有任何致瘤性的非转染人角膜内皮细胞系，成功解决了组织工程人工角膜内皮规模化重建无法获得大量种子细胞的问题。因此，尽早建立理想载体支架的规模化制备技术，进而为组织工程人工角膜内皮规模化重建创造条件，已成为各国学者们开展角膜组织工程研究的主攻目标，也是全世界角膜内皮盲患者重见光明的希望之所在。

发明内容

本发明的目的就是利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮的载体支架，提供一种组织工程人工角膜内皮载体支架的制备方法。

本发明的方法：首先用眼科镊撕除低温保存的新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净后，放入1∶1000硫酸妥布霉素液(500万单位，用0.9％生理盐水配制)中，放置在无菌操作台内浸泡消毒20～30分钟，用无菌D-Hanks溶液漂洗3～5分钟。

将已灭菌滤纸平铺于无菌玻璃板上，滴加0.1％～0.3％胰蛋白酶和0.01％～0.02％EDTA消化液(1∶1)使滤纸充分湿润，将漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平铺于滤纸上，放置至37℃培养箱中消化30～60分钟，即倒置消化法。

然后，用细胞刮刀轻刮羊膜的上皮面，以全部去除残留的上皮细胞，用无菌D-Hanks溶液冲洗3～5次，获得去上皮层羊膜，用打孔器将羊膜打成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO₂培养箱中、37℃进行干贴15～25小时。

最后，在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中，按1毫升/孔的量轻轻加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理15～25小时，无菌吸出包被液并晾干，即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。

本发明所用去上皮层羊膜专用包被液的配方为：D-Hanks溶液，0.075‰～0.125‰IV型胶原；

为了提高人角膜内皮细胞在去上皮层羊膜载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.075‰～0.125‰纤连蛋白；

为了进一步提高人角膜内皮细胞在去上皮层羊膜载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.0075‰～0.0125‰层粘连蛋白。