[发明专利]真核细胞中高化学计量的非遗传性突变的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定非遗传性突变的方法，尤其是应用整体蛋白质组学方法结合DNA测序以及可采用特异性结合蛋白质突变残基及侧翼序列的亲和试剂去鉴定真核细胞中高化学计量的非遗传性突变的方法。

背景技术

基因突变与诸如癌症、神经性疾病和代谢异常等多种疾病相关^(1，2)。就西方国家最主要的致死疾病之一癌症而言，基因突变是其主要诱因。无论是体细胞还是生殖细胞中，即使只有1％的基因发生突变也会导致癌变⁽³⁾。因此，在过去几十年里，随机基因突变与癌症的相关性研究是肿瘤生物学的一个主要研究领域，研究证明了基因组的完整性在健康与疾病中的关键角色。

在生物信息流动中，基因先被转录为mRNA，随后mRNA被翻译为蛋白，整个过程通常能正确地进行。在这个过程中如果基因发生突变，则改变的DNA信息传递给突变蛋白质，最终影响细胞的生理学功率。除基因突变之外，蛋白质序列改变在原则上可以发生在蛋白质合成过程中的任一步骤。如转录和翻译过程中的错误整合可能会产生由单氨基酸替换的蛋白质突变。由于这种蛋白质突变是由蛋白质合成过程中的错误而不是DNA突变引起的，我们将这种现象命名为非遗传性突变(NGM)(参见图1所示)。

蛋白质合成的错误率已在模式生物和特定的基因中进行过研究。这些研究建立了一个长期被接受的观点，即蛋白质合成的错误率非常低^(4，5)。自上世纪70年代，通过体外RNA聚合酶II的转录分析，对转录错误已进行了充分研究，研究表明转录过程中的典型错误率在10^-5至10^-6之间^(6-9)。蛋白质翻译过程中的错误研究在四十年前就已开展起来，现今的研究主要集中在如细菌、酵母等低等生物的特定基因上。由于tRNA合成酶在tRNA氨酰化时的错误和核糖体选择tRNA时的错误，翻译过程中的错误率估计在10^-3至10^-4之间^(9-13)。此外，目前尚不知由转录和翻译过程中的错误整合导致的蛋白质突变是随机发生在蛋白质氨基酸序列上或集中在某些特定残基上。

对细胞内蛋白质合成的错误率进行全面评估是一项困难的工作，迄今尚未全面开展起来。近年来，随着蛋白质组学技术的发展，使得系统分析由NGM引起的蛋白质突变成为可能。在过去十年里，基于大规模质谱分析的“鸟枪法”蛋白质组学技术成为蛋白质和蛋白质翻译后修饰位点鉴定必不可少的手段^(14，15)。数据检索算法的进展得以开发串联质谱的非限制性序列比对用于鉴定所有可能的蛋白质翻译后修饰^(16-19)。该方法同样可用于系统分析突变或寡核苷酸多态性(SNP)。然而，考虑到非限制性序列比对的典型性高错误率，以及诸如对合成多肽MS/MS严格验证手段的缺失，上述研究的可靠性尚未能充分保证。此外，对于突变是发生在DNA序列上还是蛋白质合成过程中的这一根本问题仍未能解答。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于质谱分析的蛋白质组学技术和基因组DNA测序对真核细胞线粒体蛋白质组中非遗传性突变的鉴定及半定量方法。

本发明的鉴定方法包括三个主要步骤：首先，对从真核细胞中提取的线粒体蛋白质进行大规模的蛋白质组学分析及PTMap扫描，准确识别所有可能带有点突变的NGM候选多肽；其次，对突变型合成多肽高解析度的MS/MS及MS/MS/MS分析，将其分析数据与数据库进行比对搜索，确认含有点突变的多肽；验证野生型突变多肽与突变型合成多肽的化学同一性；最后，对含有点突变的多肽的对应DNA片段进行基因组DNA测序，以证实这些点突变是由蛋白质合成过程而不是由基因点突变所造成的，即是非遗产性突变。

在上述方案中，所述的PTMap是一种新型的非限制性序列比对算法。该算法基于这样一种概念：根据肽段的理论上的离子化片段，一次真实的串联质谱肽段鉴定应该能够解释所有主要肽谱峰⁽¹⁷⁾。研究表明该算法具有高可靠性及低假阳性⁽¹⁷⁾，并可用于鉴定与所有已知及新的可能存在的蛋白质翻译后修饰方式对应的肽段质量位移^(20，21)；同样，该算法也能用于鉴定SNPs及NGM。