[发明专利]一种用于大型绿藻生物反应器的表达载体及其转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域，特别涉及一种转基因大型绿藻(浒苔、长石莼等)生物反应器的表达载体的构建及其转化方法。

背景技术

大型绿藻生长十分快，去富营养化效果特别好，并能有效抑制赤潮发生，是目前理想的海洋生态修复者。大型绿藻也是一种比较理想的“海藻反应器”，可以用来生产重要生物活性物质、开发海藻能源。我国是世界上藻类养殖业最发达的国家之一，其中海带、紫菜养殖产量分别占世界第一位和第三位。自90年代中期以来，海藻生物活性物质的发现以及海藻制药技术的兴起，为海藻综合利用开发开辟了新的途径。

由于现代生物技术的发展，从细胞水平到分子水平进行大型海藻的遗传机理研究，实现快速培养优良品种，以及利用细胞工程技术快繁优良种苗，对于促进传统海藻养殖业的持续发展和建立新型养殖产业，具有重要意义。虽然世界上各种转基因植物已经产生了巨大的经济效益，但海藻的转基因研究整体进展缓慢。我国大型绿藻转基因研究几乎为空白，且主要在海带、紫菜、裙带菜等海藻中开展。这是因为海藻与高等植物不同，海藻转基因难度较大。主要原因有：1)长期以来由于未找到理想的抗性筛选标记，极大制约了海藻转基因的发展；2)还没有建立稳定表达体系，大多数只能达到瞬间表达水平。

现在仅海带获得理想筛选标志基因，已取得了较大研究进展，有稳定表达报道，并分别获得了疫苗转基因海带、乙肝病毒表面抗原转基因海带等。但与高等植物相比，海藻转基因研究还十分落后。目前，绝大多数研究完全借鉴高等植物的技术，利用大型海藻的组织切块或原生质体为转化受体，仅实现了外源基因的瞬时表达，在原生质体再生的新植株中未检测到外源基因的稳定表达，由于只使用了一种高等植物来源的启动子(CaMV35S)，因而效率较低，大型海藻对抗生素的敏感性试验尚未涉及。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，在受到紫外或蓝光激发时，会发射荧光。由于其能在不破环细胞和进行化学染色的情况下直接成像，近年来在生物化学和细胞生物学中得到广泛应用。野生型绿色荧光蛋白折叠受温度影响，发光较弱；在植物细胞内的表达频率并不高。通过对其生色团氨基酸、密码子、启动子和基因序列的改造，绿色荧光蛋白荧光更稳定灵敏性更高、对细胞毒性更小、激发时间更长并能通过活体观察。

作为报告基因，绿色荧光蛋白在微生物、动物、单子叶植物、双子叶植物都获得成功表达。在藻类基因工程中，GUS和lacZ作为报告基因都是通过化学染色方法进行检测，虽然其技术成熟，灵敏度高，但都无法进行活体表达水平的跟踪检测，而绿色荧光蛋白由于其先天优势，很好的解决了这一难题。目前已获得绿色荧光蛋白在紫菜、海带配子体中瞬时表达；莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻中表达，但在大型绿藻中其作为报告基因尚未成功。长石莼(缘管浒苔)生长快速，不仅可以作为理想的生态修复海藻，而且利用其折叠组装以开发复杂结构的药用蛋白，与哺乳动物相比，其成本更低周期更短。

浒苔，又称为长石莼(Enteromorpha spp.或Ulva spp.)是一种大型绿藻，俗称苔条、青海苔等，为绿藻门石莼目石莼科浒苔属的藻类植物，常见的有缘管浒苔、扁浒苔、条浒苔、肠浒苔等。国外通常将浒苔属和石莼属都并为一个石莼属(Ulva)。浒苔的价格在日本海藻市场最高，比紫菜价格还高。目前我国南方也已开展浒苔、礁膜人工栽培。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种应用于大型绿藻生物反应器中的含有绿色荧光示踪和融合蛋白基因的载体。本发明以大型绿藻原生质体为受体，充分利用高等植物现有载体或应用同源重组技术改造载体，构建了大型绿藻生物反应器的表达载体，以实现外源基因能够在大型绿藻中高效并稳定表达。

本发明又一要解决的技术问题是，提供上述的表达载体的转化表达方法。

为解决上述技术问题，采用的技术方案为：

一种用于大型绿藻生物反应器的表达载体，其特征在于，所述的载体为Psv-bar-ZsGreen，其上依次连接SV40启动子、抗性基因、CMV启动子以及MCS多克隆限制酶切位点。

所述的载体在MCS下游融合有荧光蛋白基因ZsGreen的报告基因。

所述的抗性基因为bar基因。

在所述的SV40启动子前连接有至少一松弛型复制子；所述的载体为松弛型载体。

所述的载体中还连接有Amp抗性基因。