[发明专利]用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及一种标志膜蛋白，具体地，涉及用于纯化富集真皮内多向分 化潜能细胞的标志膜蛋白。

背景技术

干细胞在细胞治疗、基因治疗以及组织工程等方面的广泛应用前景，使 其成为近年来生命科学领域研究的热点。而成体干细胞因不涉及医学伦理问 题，同时具有多向分化潜能以及自体取材等优点，更是该领域的研究焦点。 目前已从骨髓、脂肪、肌肉等多种组织内分离获得了具有不同分化能力的 成体干细胞，部分细胞(如骨髓基质干细胞)已成功用于组织和器官缺损的 修复。

皮肤是人体表面积最大的器官，细胞资源丰富，而且位置表浅、易于取 材。近来研究表明，真皮内同样存在具有多向分化潜能的细胞(skin-derived precursors，以下简称SKPs)。SKPs能在特殊的培养液内悬浮生长及长期传代 培养(可体外培养1年以上)；体外培养时能聚集生长，表达神经干细胞的标 志物巢蛋白(nestin)，不表达波形蛋白(vimentin)。SKPs能够向多种神经细 胞，如神经元、神经胶质进行细胞分化；不仅如此，SKPs还能向部分中胚层 细胞，如脂肪细胞及平滑肌细胞分化。虽然SKPs在皮肤内的具体分布及根本 作用尚未被彻底了解，但是它所具有的多胚层(神经外胚层及中胚层)分化及 自我更新能力，均说明其为皮肤来源的成体干细胞。

经大量研究发现，真皮内的主要细胞群体——成纤维细胞内存在同时向 中胚层、内胚层及外胚层分化的细胞，即多潜能真皮成纤维细胞(Multipotent Dermal Fibroblasts，以下简称MDFs)。MDFs能在常规的贴壁生长和长期传 代培养，表达多种间充质干细胞的标志物，如Vimentin、CD105、CD49d、 CD29、STRO-1等，不表达CD34、CD133等造血干细胞的标志物；体外多向 诱导后能同时向成骨-成软骨-成脂肪方向分化。对MDFs的单细胞克隆进行研 究后发现，大部分克隆均能在体外长期传代培养，其染色体均未出现异常； 体外诱导实验显示约6.4％的克隆具有成骨-成软骨-成脂肪的三向分化能力， 19.2％的克隆具有双向分化能力。值得一提的是，部分MDFs克隆甚至表现出 跨胚层分化的潜能，如向神经外胚层和内胚层(肝细胞)分化。

MDFs的扩增和多向分化能力提示了其潜在的临床应用价值。然而，该 细胞的含量很低，如果不进行细胞分选，其中夹杂的大量无分化能力细胞将 影响疗效。为此，找到能用于分选纯化的特异性标志物是关键。流式细胞分 析是常用的细胞表面标志物研究方法，如在骨髓基质干细胞研究中，可通过 流式细胞分析多种表面标志物(Marker)：SH2(CD105)、SH3(CD71)、CD29 等的表达。但该方法只能检测一些已知的细胞表面分子，具有一定的局限性。 基于分子水平的芯片技术为干细胞Marker的寻找提供了新的手段；这些技术 可通过全面系统地比较两种细胞群体的基因表达差异，从中发现与多向分化 潜能有关的基因，找到有效的干细胞Marker。但通过这些技术分析往往会得 到庞大的数据量；因此，找到能有效筛选真皮内的MDFs的标志物(Marker) 是面临的主要问题。

发明内容

本发明提供了用于纯化富集真皮内多向分化潜能细胞的标志膜蛋白，该 标志膜蛋白可作为分选、纯化、富集多分化潜能细胞的Marker，直接用于进 行真皮内的多向分化潜能活细胞的分选。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于纯化富集真皮内多向分化潜 能细胞的标志膜蛋白，该标志膜蛋白由以下步骤获得：

步骤1，真皮来源细胞经体外培养、扩增，并经包括(但不仅限于)有限稀 释法稀释和96孔板培养等方法在内的步骤，获取若干单克隆细胞；

步骤2，对上述步骤1得到的单克隆细胞进行多向诱导，包括但不仅限于 成脂肪、成骨及成神经体外诱导，并鉴定其分化能力；

步骤3，以膜蛋白提取液分别提纯双向克隆细胞和三向克隆细胞，获得相 应的膜蛋白组分；

步骤4，对上述步骤3获得的膜蛋白，通过双向电泳分析，找出三向克隆 和双向克隆的差异蛋白点；

步骤5，通过质谱分析，获得与上述的差异蛋白点相匹配的蛋白质结果；

步骤6，通过Western-Blot法检测上述匹配的蛋白质，找出呈现阳性的差 异膜蛋白。