[发明专利]一种检测禽副粘病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对不同血清型禽副粘病毒进行快速检测的方法。

背景技术

禽副粘病毒(Avian paramyxovirus，APMV)属于单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)，它包括9个血清型，即APMV-1(Avian paramyxovirus type-1)～APMV-9(Avianparamyxovirus type-9)。其中APMV-1包括所有新城疫病毒，是禽类最重要的病原体之一，也是迄今为止研究最为全面深入的一类禽副粘病毒。禽副粘病毒的基因组为单股负链RNA，大小约为15kb或19kb，编码6种主要的结构蛋白，包括核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和多聚酶蛋白(L)。目前已经获得除APMV-5以外的所有血清型禽副粘病毒的全基因组序列，但对APMV-2～APMV-9的致病性和基本生物学特性研究尚较为缺乏，给禽副粘病毒的检测和诊断带来了很大难度。

传统的禽副粘病毒抗体检测方法主要有血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等，抗原检测方法主要是传统的病原分离方法。确诊通常需要进行病毒分离，并利用不同血清型特异性单因子血清采用HI试验进行疑似分离物鉴定，有时还要进行更为复杂的病毒毒力测定以及动物回归实验等。传统的病原分离方法虽然有效，亦在临床诊断中发挥着重要作用，但也存在确诊耗时较长(通常要一周以上时间)的明显局限性。

生物技术的飞速发展极大地推动了生命科学各个领域的发展，疾病的诊断、病原的检测已从细胞水平进入分子水平。禽副粘病毒分子结构与致病性关系研究的日益深入为副粘病毒的特异性诊断技术研究奠定了基础。根据不同致病性毒株存在的分子结构差异，相继建立了特异、快速的分子诊断技术，包括单克隆抗体技术、核酸探针技术、限制性核酸内切酶分析、基因片段的体外扩增技术和寡核苷酸指纹图谱技术等。这些技术不仅应用于副粘病毒的检测、鉴定和特性研究及致病性的检测，还可以追踪病毒的来源及流行情况。

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，现已被广泛应用。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)能够选择性地将禽副粘病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。1991年Jestin首次发展了新城疫病毒的RT-PCR检测方法，扩增F蛋白基因的238bp的目的片段。Veronique(1991)等用RT-PCR方法扩增出约275bp的F基因产物并绘制出酶切图谱，证明这些病毒株都具有NDV的共同抗原表位。Seal等(1995)用PCR扩增M基因和F基因裂解位点编码片段，通过对病毒分子进行同源进化分析，并预测了每株病毒的可能致病性。Kant(1998)利用4条引物配成三对，分别对通过匀浆组织提取的NDV-RNA进行RT-PCR，结果扩增出362、254、254bp的三个片段。该方法不需要鸡胚接种，节省时间，24h之内可以出结果，为NDV毒株的区别诊断提供了依据。Gohm等(2000年)用RT-PCR检测组织和粪便中的新城疫病毒。大量研究结果证明，利用特异性引物对NDV进行RT-PCR扩增是一种快速、准确的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测方法的不足，提供一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对不同血清型禽副粘病毒进行快速检测的方法，该法操作简便，并且可以同时进行大量样本分析。

为了实现本发明目的，本发明的一种检测禽副粘病毒的方法，包括如下步骤：1)样本的预处理；2)样本总RNA的提取；3)对步骤2)的总RNA进行RT-PCR，得到样本cDNA；4)利用权利要求1的引物，对步骤3)的cDNA进行PCR扩增；5)分析PCR产物，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带。如果扩增出目的条带则证明为禽副粘病毒检测阳性，否则为禽副粘病毒检测阴性。