[发明专利]在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法

权利要求书

1.在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶基因的构建：

(1)在50μl的体系中，加入5μl 10×限制性内切酶反应缓冲液，并按1μg DNA∶3-5U 限制性内切酶的比例加入DNA和限制性内切酶，混匀后37℃保温2-12小时，使用该方法 分别用相同的限制性内切酶消化切割pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA；

(2)用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的 DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段；

(3)在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T₄DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例 加入限制性内切酶消化过的pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA，再加入1μlT4DNA 连接酶，16℃水浴4-12小时将细菌漆酶基因插入pMAL-c2x质粒上的多克隆位点，使细 菌漆酶基因连接在pMAL-c2x质粒上携带的麦芽糖结合蛋白基因malE的后面，形成一个 重组表达质粒；

B、阳性转化子的筛选：利用常规的CaCl₂法制备E.coli DH10B感受态细胞，然后 将5-10μl连接反应混合物与100μl E.coli DH10B感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃ 热休克1.5分钟后立即置冰上5分钟，加入900μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养 45分钟，摇床转速为150rpm，然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB 平板上，37℃培养12小时，平板上长出的单个菌落即为阳性转化子；

新鲜LB培养基组成为蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、加水至1L、pH7.0；

LB平板组成为蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、琼脂1.5g、加水至1L、pH7.0；

C、融合蛋白的表达：将单个的阳性转化子接种到5ml含50μg/ml氨苄青霉素(Amp) 的LB培养基中37℃培养12小时，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨苄青霉 素的LB培养基的摇瓶中20℃摇动培养，摇床转速为250rpm，当OD₆₀₀值达到0.6-0.8时 加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-1硫代半乳糖苷)诱导6-8小时，细胞经 4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有200mM NaCl的20mM TrisHCl缓冲液中，其 pH7.4，超声波破碎，12000rpm离心收集上清液；

D、可溶性融合蛋白的鉴定：取10-15μl上清液上样，经10％SDS-PAGE电泳120V、1.5 小时后，考马斯亮蓝染色1小时，与单一细菌漆酶基因表达的可溶性漆酶蛋白相比，可溶 性融合酶蛋白的比例提高到65％以上，单一细菌漆酶基因表达的可溶性漆酶蛋白比例 ＜10％；

E、融合蛋白的纯化：将50ml上清粗酶液与10ml麦芽糖亲和层析树脂混合，4℃缓 慢摇动4-12小时，然后将混合物装柱并用缓冲液A平衡，流速为1ml/min，用缓冲液A 洗柱10-15个床体积后，再用缓冲液B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱液，目的蛋白经 10％SDS-PAGE电泳鉴定，纯化后的蛋白经65％硫酸铵沉淀浓缩后再用50mM pH7.2的磷 酸缓冲液透析去除残余的硫酸铵，在实验室摇瓶发酵条件下，从培养物中可获得纯蛋白；

缓冲液A为20mM TrisHCl pH7.4、200mM NaCl，

缓冲液B为20mM TrisHCl pH7.4、200mM NaCl、10mM麦芽糖；

F、酶动力学参数测定：使用漆酶底物ABTS(2，2’-联氮基-双(3-乙基苯丙噻唑啉-6- 磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)检测，麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白具有与未融合的 细菌漆酶相似的酶动力学参数，以DMP为底物时，反应体系为pH8.0的50mM TrisHCl、 0.2mM CuSO₄和浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.6、1mM的DMP，以ABTS为底物时，反应 体系为pH3.0的50mM醋酸缓冲液、0.2mM CuSO₄和浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、2mM的ABTS，在反应体系中加入1-5μl适量稀释的纯酶后启动反应，用MV-2550型 紫外分光光度计在37℃条件下测定酶动力学参数Km、Vmax和Km/Vmax值。