[发明专利]一种抗肿瘤人源单链抗体

说明书

技术领域

本发明涉及一种人源抗体。具体地说是一种具有抗肿瘤活性的特异性识别CDK4蛋白的人源单链抗体的基因获得及活性表征。

背景技术

肿瘤是威胁人类生命健康的主要杀手，目前尚缺乏有效治疗手段。

肿瘤细胞恶性增殖的主要原因之一是细胞周期失控。Evan GI等2001年在Nature，2001，411：342-348中提出细胞周期调控机制的核心是周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)时相性激活。CDKs是一类Ser/Thr蛋白激酶，其活性依赖于与周期蛋白(Cyclin)的结合。CDKs的异常活化将导致细胞周期失控，从而诱发肿瘤的形成。Malumbers M等2005年在Trends in Biochemical Sciences，2005，30(11)：630-641中总结提出，目前已发现11种同源的CDK分子，即CDK1～11。其中Matsushime等1992年在Cell，1992，71(2)：323-334中最早分离得到CDK4基因，CDK4基因定位于染色体12q13～14，mRNA序列全长为2.14kb，其cDNA开放读码框架为912bp，编码303个氨基酸的蛋白质，分子量约为34kD，与CDK2非常接近。CDK4主要存在三个功能区：在9～28个残基之间，是ATP的结合部位和该酶的活性部位；在42～51个残基之间，是调节亚基的结合部位；在177～208个残基之间，是p13的结合部位。因为CDK4分子中缺乏典型的PSTAIR序列，故CyclinA、Cyclin B和Cyclin E均不能激活CDK4，只有Cyclin D家族成员对CDK4具有活化功能。

Sherr CJ and Roberts M 2004年在Genes Dev，2004，18：2699-2711中指出CDK4作为细胞进入增殖周期第一个被激活的周期蛋白依赖性蛋白激酶，通过与CyclinD1结合形成有活性的CyclinD1/CDK4激酶复合物，促进细胞G0→S期的转换，是细胞周期进程中G1/S期转换的限速因子。Deshpande A等2005年在Oncogene，2005，24：2909-2915中提出在许多肿瘤细胞中存在CDK4过度表达和过度活化，与肿瘤的发生、发展有着密切关系。Bonin S等2006年在Virchows Archiv，2006，448(5)：539-544中发现CDK4与肿瘤的预后密切相关。美国Reddy等人2005年在Cancer Res，2005，65(22)：10174-10178的研究结果显示CDK4的表达是导致一些乳腺癌发生的必要因子，并提出抑制CDK4活性的治疗可能是治疗乳腺癌高度特异性的途径。哈佛医学院的Yu等2006年在Cancer Cell，2006，9(1)：23-32中对CDK4基因敲除鼠模型的最新研究结果表明，乳腺癌的发生、发展需要CDK4激酶的持续活化，因此，Malumbres M和Barbacid M 2006年在Cancer Cell，2006，9(1)：2-4中也提出抑制CDK4激酶活性将有利于乳腺癌治疗。这些结果都为CDK4作为肿瘤治疗的一个有效靶点提供了实验依据。

Dai Y和Grant S 2004年在Curr Oncol Rep，2004，6(2)：123中提出抑制CDK4催化活性的小分子化合物能够阻滞肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制CDKs活性的研究将为肿瘤治疗药物的设计提供新思路。桑建利等1999年在科学通报，1999，44(2)：184中利用反义RNA抑制乳腺癌细胞中CDK4基因的表达，致使细胞的增殖速率和致瘤性明显降低，抑制肿瘤细胞增殖。Grillo M等2006年在Breast Cancer Res Treat，2006，95(2)：185-194中证实通过应用针对CDK4的siRNA作用于肿瘤细胞时，肿瘤细胞的生长均得到了控制。这些研究成果表明，抑制CDK4活性均能抑制肿瘤细胞增殖，CDK4是肿瘤治疗的一个有效靶点。

但上述抑制CDK4活性的抗肿瘤治疗研究中存在如下问题和缺点：首先，小分子抑制剂的特异性和肿瘤细胞靶向性问题很难解决，这样就会产生明显的毒副作用；其次反义技术及RNA干扰技术存在相对不稳定、作用范围较窄等问题。因而不能实现CDK4的靶向、高效灭活。