[发明专利]一种内切-β-葡聚糖酶基因

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种内切-β-葡聚糖酶基因。

背景技术

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶属于糖苷水解酶，传统上被分为三类组分：内切-β-葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EG，EC 3.2.1.4)，CMC酶；外切-β-葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91)，即纤维二糖水解酶，CBH；β-葡萄糖苷酶(β-1，4-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)，简称BG(Fang-yuan，Chao-yin et al.2008)。现有的生产纤维素酶的菌种多为里氏木霉(Trichoderma reesei)，这些菌株在纤维素基质上生长迅速、易于培养，发酵工艺成熟，其不足之处是所生产的纤维素酶(尤其是内切-β-葡聚糖酶)的比活力较低，实际应用中酶的用量大，成本偏高。

瘤胃厌氧微生物能够分泌高比活力的内切-β-葡聚糖酶，近年来这类微生物已经受到了越来越多的关注(Wood，Wilson et al.1986；Teunissen andOp den Camp 1993)。但由于厌氧微生物需要严格的培养条件，生长速度慢，且酶系单一，目前并不适合规模化生产。将厌氧真菌的纤维素酶基因导入里氏木霉细胞中，可以取长补短，使现有纤维素酶生产菌株的发酵性能得到改良。

要使厌氧菌的内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉细胞中得到有效表达，首先要解决异源蛋白表达中存在的密码子偏好问题。已有研究表明，好氧真菌如Trichoderma reesei通常偏好GC碱基，且三联密码子的摆动位置偏好G或C。然而，瘤胃厌氧微生物的纤维素酶基因普遍偏好AT碱基，而高AT序列往往被好氧真菌误认为是修饰或切割信号，导致蛋白不完全表达和分泌(Nicholson，Theodorou et al.2005)。

另据文献报道，在里氏木霉中表达异源蛋白时，若将目的基因与适当的同源linker序列或催化结合区域(CBD)组成融合基因，将更有助于异源基因的表达(Paloheimo，Mantyla et al.2003；Paloheimo，Mantyla et al.2007)。

传统的对真菌的遗传转化方法主要是PEG介导的原生质体法、电激法和基因枪法，这些方法除了原生质体制备过程复杂、重复性差，耗时费力，普遍存在转化效率低、转化子不稳定等问题(Fincham 1989)，制约了丝状真菌转化和研究应用。

发明内容

本发明提供了一种编码内切-β-葡聚糖酶的基因，通过将该基因导入里氏木霉，该基因可以在里氏木霉中高效表达。

一种内切-β-葡聚糖酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明基因根据里氏木霉(Trichoderma reesei)的密码子偏好，利用密码子简并性，通过生物信息学软件(DNA2.0)对来自瘤胃厌氧菌的内切-β-葡聚糖酶基因进行序列优化后得到。

一种包含上述内切-β-葡聚糖酶基因的表达盒，包括编码内切-β-葡聚糖酶的基因、信号肽以及两端的启动子和终止子。

优选地，所说的表达盒的启动子和终止子分别为里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I基因的启动子(Pcbh1)和终止子(Tcbh1)。

里氏木霉分泌的纤维素酶蛋白中，纤维二糖水解酶CBHI占据了总蛋白的60％以上(Durand，Clanet et al.1988)。因此，该蛋白酶的启动子Pcbh1被认为是强启动子，将优化后的内切-β-葡聚糖酶基因装入Pcbh1和Tcbh1之间进行表达，可以增加表达效率。

一种包含上述内切-β-葡聚糖酶基因的重组载体。

优选地，所述的重组载体含有潮霉素B磷酸转移酶表达盒，所述的潮霉素B磷酸转移酶表达盒由依次连接的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)色氨酸合成基因的启动子(PtrpC)和潮霉素B磷酸转移酶基因(hygB)构成；所述的潮霉素B磷酸转移酶的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，可以通过潮霉素B筛选转化菌株。

一种含上述内切-β-葡聚糖酶基因的转化子，宿主细胞优选为丝状真菌，最好为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

优选地，所述的转化子通过如下方法制备：