[发明专利]一种纤维二糖酶基因

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种纤维二糖酶基因。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)是常用的纤维素酶生产菌种，它所生产的纤维素酶复合体系中包括：内切-β-葡聚糖酶(endoglucanase，EG，EC3.2.1.4)、外切-β-葡聚糖酶(exoglucanase)或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)、纤维二糖酶(EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶β-glucosidase)等组分(Nevalainen，H.andM.1995)。纤维素酶在将纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠不同组分之间的协同作用才能完成。

里氏木霉的cbh1基因受强启动子调控，其表达水平较高，通常CBHI酶蛋白在总分泌蛋白中的比例约占60％以上(Durand，Clanet et al.1988)。cbh1启动子的这一特点，在外源真核基因的表达调控方面具有重要的应用价值(Johan Karlsson，Markku Saloheimo，Matti Siika-aho，Maija Tenkanen，Merja Penttila，Folke Tjerneld.Eur J Biochem.2001.ArjaMiettinen-Oinonen，Pirkko Suominen.2002)。

里氏木霉的不足之处是产纤维二糖酶的能力较低，在利用里氏木霉纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，由于纤维二糖酶活力的匮乏，反应体系中常常出现纤维二糖的累积，而纤维二糖的累积对内切型-β-葡聚糖酶及外切型-β-葡聚糖酶的水解反应具有很强的反馈抑制作用。在纤维素酶的反应体系中补加纤维二糖酶，或利用固定化纤维二糖酶的协同作用可以明显提高纤维素的糖化效率(Xueliang Shen，Liming Xia 2003，2005)，但酶解成本也随之提高。

提高现有里氏木霉纤维素酶制剂中纤维二糖酶的活力，对于增强纤维素酶的协同降解性能，促进纤维素酶在生物质能源产业化中的应用等具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种编码纤维二糖酶的基因，该基因可以在里氏木霉中高效表达，解决了里氏木霉产纤维二糖酶的能力较低的问题。

一种纤维二糖酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

一种包含上述纤维二糖酶基因的纤维二糖酶表达盒，包含信号肽、纤维二糖酶基因以及两端的启动子和终止子。

优选地，维素二糖酶表达盒的启动子和终止子分别为里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I启动子(Pcbh1)和终止子(Tcbh1)。

里氏木霉分泌的纤维素酶蛋白中，纤维二糖水解酶CBHI占据了总蛋白的60％以上(Durand，Clanet et al.1988)。可以得知，该蛋白酶的启动子Pcbh1是强启动子，将优化后的纤维二糖酶基因装入Pcbh1和Tcbh1之间进行表达，可以增加表达效率。

一种包含上述纤维二糖酶基因的重组载体。

优选地，该重组载体的原始载体一般选择PUC18或PUC19。该类载体拷贝数较高，自我复制能力较强。

优选地，上述重组载体含有潮霉素B磷酸转移酶表达盒，所述的潮霉素B磷酸转移酶表达盒由依次连接的里氏木霉丙酮酸激酶的启动子(Ppkil)和潮霉素B磷酸转移酶基因构成。潮霉素B磷酸转移酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，转化子可以通过潮霉素B进行筛选。

一种含有上述纤维二糖酶基因的转化子，宿主细胞为丝状真菌，最好为里氏木霉(Trichoderma reesei)，里氏木霉产纤维素酶的能力较高。

本发明基因能够在里氏木霉中进行高效表达，转化子的纤维二糖酶活力可达到原始菌株的19.4倍。

附图说明

图1为含潮霉素B磷酸转移酶表达盒的PUC18-HB的物理图谱；

图2为含黑曲霉纤维二糖酶基因表达盒的PUC18-CB的物理图谱；

图3为本发明里氏木霉高效表达载体PUC18-HB-CB的物理图谱。

图4为检验重组菌株为阳性菌株的的电泳图谱。

具体实施方式

实施例1黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆

1、黑曲霉总RNA的提取

将黑曲霉(Aspergillus niger CBS 513.88)接种于PDA培养基上，于30℃培养7天至孢子成熟。制备孢子悬液接种于液体产酶培养基中，30℃，180rpm条件下培养2天，制得菌悬液，用于提取总RNA。