[发明专利]基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法

权利要求书

1.一种基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法，具体通过以下步骤实现：

(1)硬件系统：由一台荧光倒置显微镜(1)及电脑(2)构成，其中荧光倒置显微镜(1)包括荧光倒置显微镜主体(A)，高精度可控电动平台(B)，平台控制器(C)，电荷耦合器(D)，汞灯(E)，汞灯控制器(F)，手动操纵杆(H)，平台控制器(C)通过接线与显微镜主体(A)相连，电荷耦合器(D)通过接口与显微镜主体(A)相连，其获取的图像信息由IEEE1394连接卡上传至电脑(2)储存，汞灯控制器(F)通过接线与显微镜主体(A)相连，手动操纵杆(H)通过接线与显微镜主体(A)相连；软件系统：高精度可控电动平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统；

(2)二乙酸荧光素染色特异性标记活细胞

准确称取适量二乙酸荧光素溶于二甲基亚砜中配成10mg/mL储备液，分装于0.6mL离心管中，置于-20℃避光储存，临用前，用磷酸盐缓冲液稀释储备液4000倍待用，

(a)二乙酸荧光素最佳染色浓度选择

在96孔板中接种人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-O2，3000个/孔，只种96孔板中间60孔，置于细胞培养箱中过夜使细胞贴壁完全，第二天，弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含系列浓度梯度的二乙酸荧光素的磷酸盐缓冲液，二乙酸荧光素浓度梯度在0.078～40μg/mL之间，每个浓度6复孔，置于室温孵育15分钟，接着用100μL/孔磷酸盐缓冲液漂洗，吸干，在高精度可控电动平台(B)上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片，激发光460-500nm、发射光512-542nm，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，选择最佳二乙酸荧光素染色浓度，作为后续所有实验的荧光染色浓度；

(b)二乙酸荧光素荧光染色测量活细胞数法线性动态范围及细胞种板细胞数量选择

HepG2细胞和L-O2细胞按照倍半稀释的方式，细胞种于96孔板内60孔中，每个细胞数量5个孔平行，从50000个/孔一直倍半稀释12个数量梯度，即25～50000个细胞每孔，孵育及细胞染色条件同步骤(a)，同时，每个细胞株各做两块板，分别用于二乙酸荧光素荧光染色和噻唑蓝法测量，扫描得到的荧光图像经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，通过绘制二乙酸荧光素法荧光强度～细胞数量对数值、噻唑蓝法吸光度值～细胞数量对数值曲线，比较两种细胞活力测定方法线性动态范围、灵敏性以及两个细胞株的选择性；

(3)对化合物或中药材中肝毒性成分开展筛选并评价其毒性

(a)采用体外肝毒性细胞模型HepG2和L-O2，细胞的种板数量为3000个/孔，细胞培养过夜让其贴壁充分；次日进行加药操作，以对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪为肝毒性阳性化合物，其中对乙酰氨基酚设定9个浓度梯度为13.65～0.053mmol/L，盐酸氯丙嗪设定9个浓度梯度为163.5～0.639μmol/L，同时设定正常细胞对照组；

(b)取化合物和中药材的不同成分与细胞HepG2、L-O2共孵育48小时，之后弃去每孔中培养液，每孔加入含2.5μg/mL二乙酸荧光素磷酸盐缓冲溶液，室温避光孵育15分钟，在高精度可控电动平台(B)上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片，激发光460-500nm、发射光512-542nm，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，结果以细胞成活率表示：

成活率％＝加药处理组荧光强度/正常对照组荧光强度×100

对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪以细胞成活率对浓度梯度做量效曲线，计算IC₅₀值，用IC₅₀值来评价毒性的强弱；

在筛选中设定正常细胞组、阳性损伤对照组及溶剂对照组，阳性损伤对照组为：13.65mmol/L的对乙酰氨基酚和163.54μmol/L的盐酸氯丙嗪，溶剂对照组为：0.1％v/v二甲基亚砜。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法，其特征在于，步骤(3)中，对于中药材，在与细胞HepG2、L-O2共孵育48小时前，需经过加热回流提取、中压柱分离及制备液相分离的前处理，将中药材分成不同的成分，每个成分用二甲基亚砜溶解成50mg/mL的储备液，中药材成分用于肝毒性成分筛选时使用浓度为50μg/mL。