[发明专利]人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别是涉及到研究人肠道病毒71型疫苗的方法。 

背景技术

人肠道病毒71型(EV71)于1969年首次被分离鉴定，是手足口病的病原体之一。该病毒主要感染5岁以下儿童，主要导致手足口病及疱疹性咽峡炎，少数情况下的并发症包括脑膜炎，肺水肿，出血等，严重病例可导致死亡。人肠道病毒71型曾引起世界范围内的多次疾病暴发流行，上世纪80年代以来，人肠道病毒71型引发的手足口病在亚太地区肆虐，引发了严重的婴幼儿死亡病例。 

我国自1981年在上海发现本病，以后各个省市均有报道。2009年3月全国通过传染病网络直报系统报告的手足口病病例是54713例，死亡31例。从今年年初到4月7号，网络直报显示，全国累计报告手足口病例115618例，其中重症773例，死亡50例。 

人肠道病毒71型多肽链全长2,193个氨基酸，在体内合成后切割成11个蛋白，包括：VP1，VP2，VP3，VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。 

目前该病的治疗尚无有效地药物，而研制安全而具有良好保护性能的疫苗，被认为是防御EV71病毒感染的有效方法。目前报道的疫苗主要是使用灭活或减毒的全病毒，或者全病毒的结构类似物，此类疫苗在小鼠模型中均能给与幼鼠良好的抗病毒保护作用。此外，VP1蛋白被普遍认为集中了优势的抗原决定簇，该蛋白被用作亚单位疫苗时，也能在体外表现出较好的保护效果，但是体内试验并不理想。 

但是，日本学者用减毒的全病毒疫苗免疫实验猴时，动物仍表现出一定的神经症状，使人们对于全病毒疫苗的安全性提出了怀疑。 

此前，我们发现了EV71病毒与人脑组织存在免疫交叉，并发现了引发这种免疫交叉的区域，据此，我们进一步设计了剔除强交叉区域的混合亚单位疫苗。 

发明内容

鉴于以上需要，本发明的主要目的在于提供一种无潜在毒副反应的人肠道病毒71型(EV71)的亚单位混合疫苗。 

本发明提供的人肠道病毒71型(EV71)的亚单位混合疫苗，其包括下述属于人肠道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为P_1-69，P_70-159，P_140-249，P_324-443，P_444-565，P_566-665，P_746-876，P_1197-1338，P_1441-1526，P_1549-1668，P_1649-1731，P_1732-1851，P_1952-2071，P_2072-2193，P_1843-1951，所述下标数字代表所述多肽在EV71多肽链中的位置，从多肽链N端起始。 

所述人肠道病毒71型可以是任何一种人肠道病毒71型毒株； 

以上述15个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，可以添加或删除少于或等于50个属于EV71多肽链的序列； 

以上述15个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，可以添加或删除任何不属于EV71多肽链编码区的序列； 

所述多肽通过以下方法筛选： 

a.人肠道病毒71型多肽链的分割和工程表达 

将人肠道病毒71型多肽链分割成由22～156个氨基酸组成的多肽，共22个，分别在大肠杆菌中表达，使用6×His tag标签进行纯化； 

b.人肠道病毒71型多肽链的分割多肽抗原性的确定 

将纯化的蛋白对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应的抗血清，确定与人体存在强交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽。 

上述步骤a中，将EV71病毒的多肽链进行顺序分割，将2193个氨基酸从N端依次分割成22～156个氨基酸构成的多肽，共22个，绝大多数多肽的分子量在10kDa左右； 

上述步骤a中，相邻并且同属于一个蛋白的两个多肽之间存在4～19个氨基酸的重叠，避免了抗原决定簇的筛选遗漏；