[发明专利]人聚角微丝蛋白基因原核表达系统及其表达蛋白的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人聚角微丝蛋白基因，即Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)原核表达系统构建及其表达蛋白的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的系统性自身免疫性疾病，由于早期临床表现不典型，极容易被忽视。因缺乏高效、特异的早期诊断技术和方法，以致错过最佳治疗时机，预后较差，严重影响生活质量。

RA特异性自身抗体中有一类重要的抗体，包括抗核周因子抗体(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗丝集蛋白(filaggrin)抗体及抗瓜氨酸抗体(抗CCP抗体)。由于这几种自身抗体具有共同抗原决定簇环瓜氨酸肽，而瓜氨酸是上述抗体识别filaggrin表位的组成成分，而被称之为抗filaggrin相关抗体。这类抗体的敏感性＞97％，特异性50～91％，其敏感性和特异性均较其他指标高(RF、抗Sa蛋白抗体、抗BiP/p68抗体和抗GPI抗体等)。研究显示抗filaggrin相关抗体在RA早期即出现，是反映早期RA的重要指标。但由于APF和AKA的抗原的特殊性(人颊黏膜上皮细胞和大鼠食道中段角质层)以及检测手段不易标准化，使它们的常规化有一定难度。目前，国内部分实验室有使用filaggrin单抗用于RA早期诊断，但因成本较高，未能广泛应用。

关于fiaggrin蛋白来源主要有以下三方面：一是从组织、细胞中直接抽提、纯化获得filaggrin蛋白，由于该方法受组织、细胞来源的局限，目前仅用于研究。二是通过人工体外合成filaggrin蛋白CCP，但因人工合成的CCP造价比较昂贵且技术要求较高，同时此种肽与体内filaggrin蛋白空间结构存在的必然差异，限制了以CCP为抗原的AFA试剂盒的研制。三是采用基因工程技术构建filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的蛋白表达系统，从而诱导filaggrin蛋白表达、纯化获得目的蛋白。此种方法较前两种方法复杂，目前国内外尚未见相关报道，但有其不可逾越的优点：通过原核表达载体表达filaggrin，蛋白经复性后，形成具有生物活性的空间结构，与体内AFA上的结合位点基本一致，为试剂盒的批量生产提供足够的、高纯度且低成本的包被抗原，从而弥补了人工合成方法带来的不足。

发明内容

本发明涉及人filaggrin基因原核表达系统构建，以及纯化蛋白的应用开发，具体包括人filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的PCR钓取、原核表达载体的构建、工程菌株的建立、目的蛋白分离纯化，以及ELISA检测试剂盒的研制。

根据人filaggrin基因序列，本发明构建了含瓜氨酸肽序列pET28a(+)-filaggrin原核表达质粒，并诱导其在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达。分离纯化蛋白，Western Blot鉴定。

将纯化蛋白定量，包被酶标反应板，经牛血清白蛋白封闭，洗涤，用于检测样本血清，测定血清抗体效价。

人聚角微丝蛋白重组基因，其特征在于该重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

所述的人聚角微丝蛋白重组基因的表达蛋白。

含有人聚角微丝蛋白重组基因的表达载体。

含有人聚角微丝蛋白重组基因的宿主菌。

含有所述表达蛋白的检测试剂盒，包括用所述表达蛋白溶液包被的酶标反应板、PBS稀释液、羊抗人IgG-HRP溶液、TMB-H2O2底物工作液、阳性对照、阴性对照。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现：

重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)，其特征在于编码Filaggrin蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

所述的人Filaggrin基因(含瓜氨酸肽编码序列)的表达蛋白属于本发明保护范围。

所述的pET28a(+)-filaggrin重组质粒所用的表达载体及工程菌株应用也属于本发明保护范围，表达载体是包含该基因的pET28a(+)-filaggrin重组质粒，工程菌株为Rosetta-gami(DE3)菌株。

所述的重组人Filaggrin蛋白(含瓜氨酸肽)在临床检测试剂开发及应用也属于本发明的保护范围。

本发明的详细描述：

1、PCR扩增人Filaggrin基因

以人淋巴细胞提取出的DNA为模板，PCR特异性扩增目的片段， 琼脂糖凝胶电泳鉴定及扩增产物割胶回收纯化。

2、人Filaggrin基因原核表达质粒的构建与鉴定