[发明专利]Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种Cre重组酶重组基因及植物表达载体。

背景技术

转基因植物(transgenic plants)是指利用生物转基因技术，将从动物、微生物、人类、远缘植物中提取的或人工合成的目的基因导入植物细胞或组织，并使其表达而产生理想性状的植物。随着转基因技术的发展，转基因植物无论是在品种数量上还是在种植面积上都发展得非常迅猛，其遍布范围几乎波及了整个地球。随着转基因植物进入人们生活的方方面面，随之而来的是人们对转基因植物的安全性的质疑，其主要原因是由于转基因植物中标记基因的存在。标记基因是一种用来筛选和鉴定转化的细胞、组织和转基因植株的DNA片段。它们主要来源于动植物，有些甚至来自细菌、病毒和其他生物体。

标记基因用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。在选择压力下不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，转化细胞由于有抗性，可继续成活、分裂并分化成植株。因此，标记基因的存在方便了植物的遗传转化；但获得转化植株后，特别是在转基因产品的产业化过程中，标记基因的存在是多余的，甚至是有害的，并具有一定的潜在危险，例如：①转基因植物本身可能变为杂草或通过杂交等方式使野生近缘种变为杂草；②标记基因传播到其他生物体中会引发生态失衡，如产生超级害虫等；③转基因植物的标记基因及其产物可能对人或动物的健康有害；④筛选剂影响转化细胞的增殖及分化；⑤相同的标记基因向植物叠加外源标记基因可能被转移到人或动物肠道寄生菌中而产生耐药性，降低或丧失某种抗生素的治疗作用。所以，目前本领域技术人员采用共转化法、位点特异性重组系统、转座子法、同源重组作用等手段去除转基因植物中的标记基因。现有去除转基因植物中标记基因的方法中应用最早、最广泛、也最深入的是位点特异性重组系统中的Cre/loxP位点特异性重组系统，由于目前尚未在真核生物中发现类似的DNA重组酶，所以将原核生物的重组酶及其相应的识别位点导入到真核生物中可实现真核生物基因组中相应的DNA片段的定位、删除和倒位等，但由于Cre/loxP位点特异性重组系统具有可逆性，导致其删除效率降低。Wierz诱变分析研究发现，对酶分子活性区域的氨基酸进行突变，结果Cre酶活性丧失或降低。Schaikh等研究得到3个Cre重组酶的突变体，将Ala36突变为Val、Thr41突变为Phe、Gly314突变为Arg，结果发现这3个突变体均不能进行DNA链的切割。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有Cre/loxP位点特异性重组系统去除转基因植物中标记基因的方法中因Cre/loxP位点特异性重组系统具有可逆性，导致其删除效率降低的问题，而提供的一种Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体

本发明Cre重组酶重组基因命名为crein基因，crein基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明Cre重组酶重组基因crein基因的长度为1222bp，本发明crein基因将内含子intron(AF354045.1)引入cre基因内部，基因的头部位置为cre基因的前3个碱基、之后为TC+内含子intron(AF354045.1)序列、再后为cre基因的后1027个碱基。

本发明Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体包含标记基因bar、crein基因、热激启动子hsp和组成型启动子CaMV35S，标记基因bar和crein基因共同位于2个同向的loxP位点内，其中crein基因由热激启动子hsp驱动，标记基因bar由组成型启动子CaMV35S驱动。

本发明crein基因可用于Cre/loxP位点特异性重组系统，本发明应用crein基因进行植物的遗传转化，通过半定量RT-PCR方法检测，Cre的表达效率提高了10％～20％，此外，由于crein基因在cre内部引入了190bp的内含子序列，因此避免了其在原核生物(如大肠杆菌和农杆菌)中的渗漏表达，从而为其与loxP位点共同存在于一个系统中的操作提供了便利。

本发明Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体的特点是在正常的生长发育温度下热激启动子hsp不具启动子活性，表现为对除草剂的抗性；而多克隆位点的存在允许了外源目的基因的组装，允许选择抗性基因和目的基因协同进入到宿主细胞当中。因此，当本发明Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体转化完成以后，可以用热激处理(42℃)的方法，去除选择标记基因。Cre作为一种重组酶，为了防止其在植物当中再次发生整合反应，在去除标记基因的同时，它也一并从植物基因组中自身删除。