[发明专利]人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体，尤其涉及人ski基因真核表达载体、制备 方法及应用。

背景技术

组织修复、创伤愈合是由于外伤或其他因素造成皮肤等组织缺损后，局部 组织通过再生、重建进行修补恢复的一系列病理生理过程。目前众多的促修复 和愈合措施中，生长因子的应用最有代表性，如TGF-β，bFGF等，但是其强烈 的有丝分裂原活性在促进伤口愈合同时可带来胶原分泌旺盛，造成瘢痕过度增 生和愈合质量的下降，限制了其在临床的应用；而在目前的瘢痕治疗中，主要 是针对于已形成的瘢痕的治疗，如手术、加压、放射、类固醇注射、干扰素、 硅酮及激光等方法(周元国.加强创伤耐受性差异的分子基础研究，促进分子创 伤学的发展.创伤外科杂志2002：4(5)：257-259)，这些方法大都治疗效果不 好，有的副作用很大甚至影响修复和愈合。因此，寻求新的促修复分子，既能 正向加速修复细胞增殖、促进愈合，又能降低胶原合成、负向调节瘢痕的形成， 使两个矛盾的过程协调统一，对促进创伤愈合尤其是放创复合伤、大面积创伤、 烧伤等难愈伤口愈合和具有纤维化倾向的组织修复，降低瘢痕形成，改善修复 质量有着十分重要的意义。

ski是一种鸟类癌基因v-ski的细胞内同源物，首先发现于禽类动物(Li Y， Turck CM，Teumer JK，et al.J Virol.1986；57(3)：1065-72)，在不同类型 的组织和细胞中分布广泛。ski参与促进神经系统发育、造血细胞的增殖和分化、 肌肉、肝分化及再生等作用(Mizuide M，Hara T，Furuya T，et al.J Biol Chem. 2003；278(1)：531-6)。过去几年，我们在国际上首先发现ski基因是一种新的 创伤修复相关基因(Liu X，Zhang E，Li P，et al.Wound Repair Regen.2006； 14(2)：163-172)，具有促愈合和减轻瘢痕形成的双重作用，ski基因的这一应用 前途已公开于公开日为2005年01月12日的第ZL 200410022266.2号专利中。 但是此质粒结构较为复杂并且没有用于人体实验的报道，因此其是否适用于临 床基因治疗还存在着很多未知的问题。为了便于临床实验和研发基因治疗药物， 需要构建使用方便、安全的Ski真核表达质粒。

pUC118结构简单，除含有1个氨苄青霉素抗性基因(Ampr)外，还有1个插 入失活的lacZ基因、自身复制起始位点和多克隆位点，具有临床使用方便、应 用安全的特点，国外已有成功将其应用与临床的报道。因此，我们以pUC118质 粒为载体，酶切连接目的基因、CMV启动子等构建pUC118-Ski真核表达质粒。

发明内容

本发明的目的在于构建一种能在皮肤组织和其它组织中表达的人ski基因 表达载体，其可以作为一种基因药物，直接进行伤口周围局部注射(或静脉注 射)、涂敷，使其在损伤组织长期、稳定、特异表达，应用于皮肤、食道、肠道 等上皮组织和其他组织、器官损伤，尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤、 慢性溃疡和褥疮等难愈伤口以及各种疤痕的预防和治疗，以取得较传统药物 更好的疗效。

本发明所述的人ski基因真核表达载体，其包含载体pUC118片段和人ski 基因片段。

其中，所述人ski基因片段为SEQ ID NO：3序列，由SEQ ID NO：1-2所示 核苷酸的引物从人皮肤原代成纤维细胞(来自临床包皮过长患者，经患者同意) 总RNA中扩增获得。

本发明所述的人ski真核表达载体，具有CMV启动子和BGH终止子。

本发明还提供所述的人ski基因真核表达载体的制备方法，其主要包含步 骤：

1)通过PCR从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中获得人ski基因片段；

2)步骤1)获得的人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切后插入pUC118 质粒中获得载体pUC118片段；

其中步骤1)中应用的扩增引物为SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸；步骤2) 还包含在pUC118质粒上插入CMV启动子和BGH终止子。

本发明所述的人ski基因真核表达载体可以应用于制备促进组织修复、伤 口愈合及抑制瘢痕形成的制剂。

本发明还提供促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其包含上 述的人ski基因真核表达载体。

所述制剂为注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。