[发明专利]耐热的芽孢杆菌及其在制备苯乳酸中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株耐热的芽孢杆菌及其应用，尤其涉及所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，又名3-苯基乳酸或β-苯乳酸，是一种近年来引起人们关注的新型抑菌物质。与Nisin等细菌素相比，具有广范的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真核微生物均有抑制作用。苯乳酸溶解性好、能在各种食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的pH范围和热稳定性。苯乳酸还是一种重要的化学合成前体，在医药、化工、生物合成等领域具有宽广的应用范围。

目前，苯乳酸合成方法有化学合成法和生物转化法两种。化学合成法在不同程度上存在技术复杂、污染环境等缺点。生物转化法主要有两种方法：微生物发酵和生物催化。

中国专利申请号200610088430.9报道了利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentose)作为菌株以苯丙氨酸、苯丙酮酸或苯丙酮酸钠为底物，添加碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵法生产苯乳酸；中国专利申请号200810021498.4报道用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS1.550控制pH和补料发酵生产苯乳酸，发酵时间70～90小时，最高产量为17.38克/升，转化率51.1％，生产强度0.241克/升·小时。苯丙酮酸是一种难溶物质，其溶解度随温度的升高明显增加，从而可以提高苯乳酸的产量和生产速率。耐热的芽孢杆菌最适生长温度高于乳杆菌，同时培养基简单，生长速度快，因而更适合苯乳酸生产，然而利用耐热的芽孢杆菌生物转化苯丙酮酸生产苯乳酸尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM，以及利用其全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的应用。

本发明所述耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM菌株已于2010年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国 武汉 武汉大学)，保藏登记号为CCTCC No.M 2010012。

本发明所述耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM是从果园长期堆放腐烂水果的垃圾堆周围土壤中筛选得到。该菌株细胞长杆状，有芽孢，能运动，革兰氏染色阳性。在培养基上产生为圆形、凸起、透明，表面干燥光滑、直径2～3毫米的菌落。它可利用葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖，不能利用丙酸盐，接触酶阳性，不能水解明胶。其16S rDNA序列与多株芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到96～98％。

本发明所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。

其中，所述应用是利用耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸，其方法步骤如下：

(1)斜面培养：将耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012接种到固体斜面培养基上，在30～60℃条件下，静置培养8～16小时；

(2)种子培养：刮取1～2环步骤(1)所得的斜面培养物接种到100～300毫升液体种子培养基中，在30～60℃、pH值5.0～7.5的条件下，100±10转/分钟振荡培养8～20小时，制得种子培养液；

(3)细胞悬液的制备：以体积比计，按3～5％的的接种量将步骤(2)所得的种子培养液接入6～8升发酵培养基中；在30～60℃、pH值5.0～7.5的条件下，100转/分钟振荡培养6～20小时；然后以4,500±500转/分钟的转速离心15±5分钟收集菌体沉淀，用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为100克/升；

(4)转化：将(3)所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖或木糖混合，调节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为50～220毫摩尔/升，辅助底物葡萄糖或木糖的浓度为10～80克/升，细胞悬液菌体干重为10～80克/升；在30～60℃、pH值5.0～7.5，100±10转/分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸；转化反应4～24小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液；

(5)样品处理与检测：取步骤(4)获得的细胞转化液先加热至100℃，再1,2000±1000转/分钟离心5±2分钟，取上清液稀释至苯乳酸浓度为0.5～2毫摩尔后，以HPLC检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。