[发明专利]一种药物心脏毒性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于药理学技术领域，具体涉及一种药物心脏毒性的检测方法。

背景技术

肿瘤治疗带来的各种副作用尤其是心脏毒性日益受到重视。能引起心脏毒性的化疗药物很多，从柔红霉素、表柔比星到环磷酰胺等都与心律失常、心包炎、心肌缺血和心肌病明显相关，此外，新型靶向治疗药物如曲妥珠单抗和lapatinib的心脏毒性也令人关注。现在研究者公认uPA-uPAR系统在肿瘤的发生发展过程中起了重要的作用，uPA不仅可以促进肿瘤细胞的增殖，而且与肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭和转移过程密切相关。在癌症患者体内，也可以检测到一些uPA-uPAR系统的蛋白质表达量高于正常水平。文献报导指出，可以采用多种方法抑制uPA-uPAR系统，来达到抑制肿瘤细胞生长和转移的目的。虽然uPA-uPAR系统对动物的发育和生殖并不必需，但uPA-uPAR系统的缺失可能对动物的心脏产生不利的影响，这个在进行抑制uPA-uPAR系统的肿瘤治疗时是需要考虑到的一个问题。

心脏是制药业的重要靶标之一，有两个原因。首先，西方国家心血管疾病是最常见的死亡原因，治疗这些疾病需要保健系统付出高额费用，说明与心脏有关的药物有巨大的市场。其次，从市场上撤药和新药审批推迟的最常见原因是出现了心脏不良反应。例如小分子酪氨酸激酶抑制剂最常见的心肌抑制引起心脏不良反应，亟需有关的毒性模型来研究。虽然成熟的标准间质细胞技术可容易地分析心肌抑制，但确立心脏毒性有关系统尚待完善。因此，在药物发现、研制和安全药理学研究中测定潜在化合物的心脏毒性是个重大问题。

发明内容：

本发明需要解决的问题的是为治疗肿瘤时可能产生的心脏毒性特别是通过抑制uPA-uPAR系统治疗肿瘤时可能产生的心脏毒性提供一个方便的检测方法。

本发明是关于一种药物心脏毒性的检测方法。主要由以下内容组成：

1整体动物模型：药物对小鼠心脏毒性指标的测定。

取32-36周龄的C57/B6小鼠，雌雄不限，每天两次皮下注射待测药物，共注射7天，第8天杀死小鼠，取出心脏，将血液洗净，测定心室重量(ventricle weight，VW)。用心室重量与小鼠体重(body weight，BW)的比值(VW/BW，g/g％)作为药物心脏毒性的指标，同时做对照(用磷酸缓冲液PBS代替待测药物)用来比较。

2细胞模型：药物对小鼠心肌细胞毒性指标的测定。

小鼠心肌细胞的体外培养。取出生3天以内的新生C57/B6小鼠20只，无菌取出心脏，用PBS将心脏中余血洗净，尽量去除心耳、血管及结缔组织，将剩余的心室肌剪成1-2mm的碎块，按照下面的步骤进行循环消化：

(1)加入消化液(0.1％trypsin，0.05％type II collagenase，1％BSA，20μg/mL DNase I inPBS)1-2mL，在35℃恒温水浴中轻轻振荡消化5min。

(2)加入5-10mL PBS，用10mL玻璃刻度吸管轻轻吹打心肌组织块1min，再静置1min让组织块充分沉淀到管底。

(3)小心吸取上部溶液，注意不要吸到底部的组织块，尽量将溶液吸完全。将吸取的溶液离心(1000rpm，5min)，取细胞重悬于10％FBS的MEM培养液中。在未消化完的组织块中加入消化液，进入步骤(1)。

循环消化直到组织块完全消化完，一般需要7-10次循环。第一次消化得到的细胞中含较多的血细胞，弃去不用，合并其余所得细胞，过300目铜网，用MEM培养液洗2次。用MEM培养液(含1％FBS，100u/mL青霉素，100g/mL链霉素)将细胞接种1-2个10cm培养皿，37℃，预贴壁1hr。由于心肌细胞贴壁较成纤维细胞贴壁慢，1hr后成纤维细胞已贴壁，而此时绝大部分心肌细胞还未贴壁。预贴壁结束后，轻轻振荡培养皿，吸取未贴壁细胞，洗1次，计数。用MEM培养液(含10％FBS，0.1mmol/LBrdU，1.5μmol/L VB₁₂，0.12μmol/LCu²⁺，0.1μmol/LZn²⁺，100u/mL青霉素，100g/mL链霉素)将细胞稀释成5×10⁵/mL接种培养皿或培养板。37℃培养过夜后换液，去除未贴壁部分。以后隔2天换液。