[发明专利]一种重组鸭α -干扰素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种重组鸭α-干扰素的制备方法。

背景技术

养鸭业在我国有着悠久的历史，无论是鸭的品种资源，还是生产数量均名列世界前茅。随着养鸭业的迅速发展，鸭产品的大规模流通，鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒病、鸭流感、番鸭呼肠孤病毒及新型鸭病毒性肝炎等新老疫病快速传播，其中，病毒病已成为我国养鸭业的主要疫病，严重威胁养鸭业的健康发展。对于病毒性疫病，目前尚无高效的治疗药物，采用疫苗免疫、高免血清被动免疫仍然是防治病毒性疾病的主要手段。但随着疫苗的长期应用使一些病毒出现了变异，导致了超强毒力株和非典型毒株的出现，致使一些传统疫苗的保护率出现下降趋势甚至无保护作用，而高免血清还潜在携带传播其他疾病的危险。因些，养鸭生产上迫切希望能提供一些广谱、价廉的抗病毒新药。

干扰素是在特定的诱生剂作用下，由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，根据其理化和生物学特性分为α、β和γ三类，其中α-干扰素以其突出的抗病毒作用而备受人们重视，现已被广泛用于人医临床。α-干扰素除具广谱抗病毒活性外，还能抑制肿瘤细胞增殖和参与调节免疫应答，具作用迅速、安全有效、无毒副作用、在体内存留时间短、无药物残留等特点，且对病毒性疾病具有预防和治疗的双重效果，是一种绿色、环保的抗病毒制剂，具有广阔的应用前景。

然而有关禽类干扰素的研究却比较滞后，1994年鸡α-干扰素基因才得以克隆和鉴定，随后Schultz等克隆了鸭α-干扰素基因，并展开了鸭基因工程干扰素抗病毒的研究。近年来国内禽类α-干扰素的研究也取得了一定的进展，如鸡、北京鸭等α-干扰素基因相继被克隆及表达，重组鸡α-干扰素已有用于抗病毒治疗的报道；但重组鸭α-干扰素由于存在复性率低下等原因至今尚未见有用于临床的报道；而采用传统方法生产的干扰素，存在产量低，成本高，成品价格极其昂贵等问题，根本无法在动物的疾病治疗中推广应用。

发明内容

本发明目的是，针对鸭病毒性疾病防治中由于常规疫苗长期使用已出现变异株，致使保护率下降甚至无保护作用，而高免血清的使用潜在有携带传播其他疾病危险等问题；提出一种价格低廉，安全有效，无毒副作用，在体内存留时间短，无药物残留，对鸭病毒性疾病，尤其是对鸭病毒性肝炎具有预防和治疗双重效果高复性率的重组鸭α-干扰素的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种重组鸭α-干扰素的制备方法，该方法按以下步骤进行：

(1)鸭α-干扰素基因合成：将Genebank公布编号为X84764的鸭α-干扰素基因序列进行合成；

(2)引物的设计和合成：根据鸭α-干扰素基因序列设计用于扩增鸭a-干扰素成熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的5`端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，该引物对的序列为：

上游引物P1：5`-ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3`

下游引物P2：5`-GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG-3`

(3)表达载体的构建：以合成的鸭α-干扰素基因为模板，用P1、P2引物扩增出鸭a-干扰素成熟蛋白基因，经BamHI和EcoRI双酶切插入表达载体PET-28a(+)BamHI和EcoRI的酶切位点，再转化入受体菌E.coli BL21-plsS，筛选出高效表达的阳性克隆菌，经测序验证正确后作为工程菌保存；

(4)工程菌的诱导表达：将阳性克隆菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液，37℃培养过夜，次日将该菌液按2％的接种量接种与上述相同LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀值为0.6～0.7；加入最终浓度为1mmol的IPTG诱导剂诱导培养4h；取菌液4000转离心10min收集菌体，置-70℃冰箱保存，备用；