[发明专利]蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物及其制备方法，确切地说就是构建一系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽镇痛活性得到提高以及分子内半胱氨酸进行改造的突变体蛋白的表达载体。具体地说，本发明涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽镇痛活性保守性半胱氨酸以及镇痛活性得到提高的突变体蛋白的制备方法及其作为镇痛药物在治疗领域中的应用。

背景技术

蝎作为传统中药已有2000多年的药用历史，又称全虫，全蝎，在“诗经”、“本草纲目”等医学著作中对其药用性即进行了系统描述，是我国的传统名贵中药，具有祛风镇惊，通络止痛等功能。用于偏、正头痛，神经痛，躯身锐痛等，具有较大的开发价值。近年来人们已经发现了多种具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗癫痫等药理作用的蝎毒单组分多肽。天然蝎毒产量极低，因此，采用基因工程方法，用简单的原核或真核生物表达宿主生产具有药用价值的活性蝎毒多肽的方法显得尤为重要。

东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(BmKAGAP)是刘岩峰等自东亚钳蝎中首次分离纯化得到并用基因工程的方法获得其编码基因序列，实现了在大肠杆菌中的高效可溶性表达。在体内小鼠醋酸扭体模型实验中，该多肽体现出较对照药吗啡强的镇痛效果(Liu YF，Ma RL，Wang SL，Duan ZY，Zhang JH，Wu LJ，Wu CF.Expression of an antitumor-analgesic peptide from the venom of Chinese scorpionButhus martensii Karsch in Escherichia coli.Protein Expression and Purification.2003；27：253-8)。

疼痛是人类共有而又有较大个体差异性的一种不愉快的主观感觉，它在躯体受到威胁时提供警报信号，是生命不可缺少的一种保护机制。而在现有研究基础上，使BmKAGAP镇痛活性得到提高以及对半胱氨酸进行改造的突变体蛋白的重组表达载体的构建及寻找高效可溶性表达产物的获得方法还有待于进一步研究。

发明内容

本发明的一个目的是构建BmKAGAP突变体表达载体，突变体蛋白的表达与纯化及初步体内生物活性研究。

本发明即致力于BmKAGAP镇痛活性得到提高以及对半胱氨酸进行改造的突变体蛋白的重组表达载体的构建及高效可溶性表达产物的获得方法，本发明所述的BmKAGAP系列突变体或相应的类似物的获得方法常规、简单、产量高，对研究开发蝎镇痛肽类药物具有重要的指导意义和实用价值，为工业化生产奠定了基础。经过初步体内活性实验验证后为该系列蛋白广泛应用于临床疼痛相关疾病的治疗提供基础，将会大大提高患者的生存质量，因此其应用前景将是非常广阔的。

本发明的另一个目的是提供生产如上限定的突变体蛋白质的方法，该方法包括：

(1)提供BmKAGAP的D8K，D8R，C端-(K或R)，C端-(K或R)-(K或R)，C端-(K或R)-(K或R)-(K或R)，C末端减少一个或二个Gly，D8(K或R)和C末端增加一个或二个或三个碱性氨基酸，D8(K或R)和C末端减少一个或二个Gly及其四对二硫键的突变体所编码DNA的重组表达载体；

(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞；

(3)在适合于表达BmKAGAP的D8K，D8R，C端-(K或R)，C端-(K或R)-(K或R)，C端-(K或R)-(K或R)-(K或R)，C末端减少一个或二个Gly，D8(K或R)和C末端增加一个或二个或三个碱性氨基酸，D8(K或R)和C末端减少一个或二个Gly及其四对二硫键的突变体的条件下培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；

(4)收获并纯化所得到的蛋白质。

本发明的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本发明的再一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。

本发明提供了一种上述载体转化的宿主细胞。

本发明提供的突变体蛋白均是从大肠杆菌宿主细胞中分离纯化得到的。可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的蛋白质表达产物。在产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测产物的存在及相应分子大小。