[发明专利]一种组织工程骨软骨复合体及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程骨软骨复合体，其中包括作为主体支架的组织工程骨软骨支架，以及作为二级支架和分布载体的凝胶类物质，其特征在于所述的组织工程骨软骨支架是通过对松质骨柱分层脱钙制备而成，上层完全脱钙，是工程软骨支架或工程软骨支架的框架部分，下层表面脱钙，是工程骨支架或骨形成材料，同时起工程软骨的固定支点的作用；所述的凝胶类物质为纤维蛋白原凝胶或藻酸盐凝胶。

2.一种制备组织工程骨软骨复合体的方法，该方法包括：

1）以动物骨或者深低温冷冻人骨为原料制备松质骨柱；

2）将步骤1）制得的松质骨柱进行分层脱钙，得到上层完全脱钙，下层仅表面脱钙的组织工程骨软骨支架，以该支架作为制备组织工程骨软骨复合体的主体支架；

3）将培养扩增后的软骨种子细胞收集后稀释于纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液中；

4）将步骤3）得到的含软骨种子细胞的纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液置于培养皿或培养板中；

5）将主体支架倒立，让支架上层即完全脱钙部分，且仅让上层沉浸于上述培养皿或培养板内的溶液中，支架下层即仅表面脱钙部分曝露于溶液外；

6）调整溶液量，添加0.1ml  2% w/v 凝血酶溶液或CaCl₂溶液，使上述溶液形成凝胶，凝胶的表面与主体支架上、下层的界面基本重合；

7）将培养皿或培养板放入4℃冰箱10分钟，取出培养板，吸出孔中多余液体，切除支架外多余凝胶，即获得所述的组织工程骨软骨复合体，其中所述的制备松质骨柱的方法为：取动物骨或者深低温冷冻人骨，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片，然后将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干后，用环钻动物骨制成直径为4mm的松质骨柱;所述的分层脱钙为：将制备得到的松质骨柱按所需比例划分为上、下两部分，下面的部分用石蜡包埋，然后将该松质骨柱整体置于EDTA溶液中脱钙，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡， PBS缓冲液浸泡1周，再冷冻干燥。

3.权利要求2所述的制备组织工程骨软骨复合体的方法，其中所述的动物骨为新鲜的牛骨股骨踝。

4.权利要求2或3所述的制备组织工程骨软骨复合体的方法，其中所述的所需比例为1∶1～1∶2。

5.权利要求4中所述的制备组织工程骨软骨复合体的方法，其中所述的所需比例为1∶2。

6.权利要求2或3所述的制备组织工程骨软骨复合体的方法，其中所述的软骨种子细胞为软骨细胞或骨髓干细胞。

7.权利要求2或3所述的制备组织工程骨软骨复合体的方法，其中所述的软骨种子细胞以4×10⁷/ml稀释于纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液。