[发明专利]人类新基因FAMLF在人基因重组、恶性肿瘤基因检测、特异性单克隆抗体的研制与应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种医药领域，尤其涉及人类新基因(FAMLF)的全长DNA序列、构建出该基因全长cDNA的T克隆、设计出针对该基因的序列特异扩增区域的PCR引物、并研制出针对该基因所表达蛋白的特异性单克隆性抗体，细分所属领域如下：

(一)分子生物学范畴。

(二)抗体制备研究领域。

(三)临床血液病研究领域。

背景技术：

随着人类基因组计划的完成，人类基因组学研究已实现从结构基因组向后基因组的全面转变，人类基因组中24中染色体的绝大部分的序列(除少数间隔外)已经明确。估计人类基因组中大约有20000-25000个基因。完成基因组序列测定成为破解人类遗传奥秘的历史性开端，接下来的任务更加艰巨，目前主要是要完成以下目标：一是识别、分离、鉴定和克隆所有基因(现在只克隆出一万多个)；二是搞清每个基因的功能及基因之间的相互作用和相互关系。有科学家估计，到21世纪晚些时候，基因治疗有可能走向临床应用大舞台，为人类健康做出重要贡献。而恶性肿瘤由于其高发病率和死亡率而成为基因治疗首选病种，肿瘤相关基因的克隆将为恶性肿瘤的基因治疗提供靶点，是基因治疗的重要基础之一。

白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤之一，估计我国白血病的发病率每年2.71/10万，每年死于白血病患者近4万人，五年无病生存率仅达20％左右，难治性复发性白血病发生率有上升趋势。白血病的生物学行为复杂多变，发病机制以及发生、发展的分子生物学基础尚未阐明。临床上对白血病的预防、治疗、预后判断尚缺乏有效的手段，骨髓移植患者的治愈率仅40％左右，目前死亡率仍居高不下。

近年来的遗传学研究表明白血病是多基因相关肿瘤，国际上对白血病基础研究的主要进展，很大一部分是来自对白血病相关基因的研究。一些研究结果表明，bcr/abl、c-myc、bcl-1、tal-1、RARa、CAN、MLL、NUP98等癌基因与白血病发生发展有密切相关。国外对白血病的研究热点集中于对白血病相关基因的克隆与鉴定，主要通过构建一般的基因组文库或cDNA文库并进行筛选，但其特异性不高，筛选阳性率较低。福建省白血病发病率高于全国，白血病患者人数众多，白血病基因资源丰富，尤其是白血病高发家系多见，其白血病遗传基因具有独特的研究价值。家族性白血病既是一种血液系统的恶性肿瘤，又是一种与遗传因素高度相关的疾病，其遗传基因具有独特的研究价值。我们1981年起对福建省山区一个白血病高发家系(家系图谱见附图一)，进行了遗传学、细胞遗传学等方面研究，目前课题组成员在以往对此急性白血病高发家系遗传机制进行相关研究的基础上，应用抑制消减杂交(SSH)等分子生物学技术，以IV-18患者骨髓作为Tester，正常人骨髓作为Driver，成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA抑制性消减文库，应用DifferentialScreening技术筛选鉴定文库，确认28个基因为阳性差异表达基因，阳性克隆送交测序，测序结果提交GenBank进行同源性比对分析，发现了17个有差异表达的白血病相关已知基因的EST片断和11个未知的白血病相关新EST片段，11个新的EST片段全部在美国NIH的基因库GENBANK成功注册。通过一步法半定量RT-PCR筛查，发现其中4条新的EST片段在髓系白血病人中高表达，而在正常人中低表达。选取4条中的zywB-87(GenBank注册号：CV973101)，通过电子克隆和SMART-RACE技术，成功克隆了有差异表达的zywB-87所对应的新基因cDNA全长，该基因定位于染色体1q31.3，cDNA全长2313bp，编码82个氨基酸的蛋白质，含有信号肽，富含亮氨酸重复单位(LRR_SD22)，内在固有无序结构域等功能区。Blast检索FAMLF为功能未知的新基因，已被GenBank收录，并被命名为FAMLF，核酸注册号为EF413001，蛋白质注册号为ABN58747。新基因FAMLF在急性髓系白血病病人中的表达明显高于正常人中的表达，差异有统计学意义(P＜0.01)，通过生物信息学分析预测新基因FAMLF很可能定位于细胞膜，参与细胞信息传递途径中某些蛋白的磷酸化；FAMLF的高表达，可能导致细胞增殖信号的持续活化，或者细胞凋亡信号的抑制，从而导致恶性肿瘤的发生。并已经通过T-A克隆的方法成功构建出包含FAMLF基因全长cDNA的T克隆，已经成功研制出针对FAMLF蛋白特异性单克隆性抗体，经过Western Bloting验证出该新基因表达的蛋白质在急性髓系白血病患者中高表达在正常人中低表达，FAMLF基因的相关功能正在进一步研究证实中。