[发明专利]大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制氢技术，具体地说是大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法。

背景技术

能源短缺和环境污染成为当代人类社会发展面临的两大难题，开发和利用清洁能源迫在眉睫。氢气能量密度高，燃烧后只产生水、不产生具有温室效应的CO₂和其它有毒气体，对环境无污染，是一种极具开发潜力的理想清洁能源。现有技术制备氢气的方法是通过水电解制备氢，但是这种方法耗费电能，实际上是以电能换取氢气能源。生物制氢是解决氢气来源可持续生产问题的重要途径之一。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞绿藻，其氢酶(H₂ase)基因在厌氧条件下被诱导表达，能将光合作用中产生的H⁺和e^-合成H₂，释放到细胞外，是利用太阳能生产氢气的理想方法。莱茵衣藻生长速度快，培养成本低，其氢酶活性高，是有极大潜力的微藻光合制氢藻种。但是莱茵衣藻氢酶对氧气敏感，很容易受氧气的抑制而失去活性；而氧气又是衣藻光合作用的主要产物。这一对矛盾限制了衣藻的产氢效果，限制了衣藻产氢技术的应用。因此，为了提高衣藻光合产氢效率，需要尽可能的降低衣藻细胞内的氧气含量。目前降低衣藻细胞内的氧气含量的办法是通过抑制光合系统II(PS II)的活性，从而实现抑制光解水放氧，但是该方法同时抑制了光合链电子传递效率，影响了衣藻的产氢效率；另一方面，缺氧条件下衣藻的生长受到严重抑制，最终影响了产氢效率。

豆科植物根瘤中的固氮酶有很高的固氮活性，与根瘤细胞中含有大量的豆血红蛋白(leghemoglobin，简称Lb)有密切关系。豆血红蛋白具有与氧气可逆结合、降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用的特性，既能维持根瘤细胞内较低的氧气含量，又能保障呼吸作用需要的氧气和固定空气中氮素需要的能量。

豆血红蛋白有两个亚基构成，一个是球蛋白亚基，由豆科植物合成；另一个是血红素辅基，由共生的根瘤菌合成。两个亚基结合成为有活性的豆血红蛋白。在植物细胞内、尤其是在叶绿体中，血红素辅基前体可以通过叶绿素合成途径合成。植物叶绿体中，原扑啉在镁螯合酶的作用下生成叶绿素；在根瘤细胞中，原扑啉在根瘤菌合成的亚铁螯合酶催化下合成血红素辅基。植物细胞中存在着具有与亚铁螯合酶相似功能和相似结构的吡啶核苷酸二硫酸氧化还原酶(pyridine-nucleotide disulfide oxidoreductase)的蛋白酶家族。

本发明针对衣藻产氢培养需要无氧条件的关键问题，利用来源于大豆(Glycine max)根瘤的豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba，解决衣藻产氢代谢过程中需要尽量降低细胞内氧气含量又尽量保证其正常代谢的技术难题。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba，解决莱茵衣藻产氢中降低细胞内氧气含量，提高氢化酶活性，又能保障呼吸作用需要的氧气的技术方法。

本发明的目的是这样实现的：

1、大豆血红蛋白基因提高莱茵衣藻生物制氢产量的方法，步骤如下：

(1)莱茵衣藻的培养：

A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；

B、培养莱茵衣藻藻种：

(a)液体培养基：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photonsm^-2s^-1)；50～100ml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐(Tris-Acetate-Phosphate简称TAP)培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；

(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；

C、产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒(μmol photons m^-2s^-1)，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；