[发明专利]用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒

说明书

本申请是<用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I和IV的RNA干涉序列及重组干涉质粒>申请号200710010099.3，申请日2007年01月15日的分案申请。 

技术领域本发明涉及一种特异的DNA序列及根据该序列构建的重组干涉质粒。 

背景技术恶性肿瘤是一种较为难治的疾病，尚无理想的治疗方法。目前，对肿瘤的治疗策略主要是采取外科手术、放射治疗和化学治疗等综合手段，但每一种方法仍具有局限性并可产生一定程度的毒副作用。 

发明内容本发明的目的在于提供一种依据肿瘤特异糖抗原合成及肿瘤生长、浸润、转移等分子机制所构建的，用于抑制LeY肿瘤寡糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I和IV的RNA干涉序列及重组干涉质粒。本发明主要是：应用RNAi(RNAi，RNA interference)技术以肿瘤的特异糖抗原为靶位点，抑制细胞表面Lewis Y(LeY)肿瘤寡糖抗原的合成。LeY分子结构为Fucα1→2Galβ→4(Fucα1→3)GlcNAc)，即通过设计并合成LeY肿瘤寡糖抗原的关键酶岩藻糖基转移酶I(Fucosyltransferase I，简称FUT1)和岩藻糖基转移酶IV(Fucosyltransferase IV，简称FUT4)基因的干涉序列，并采用分子克隆重组技术构建重组FUT1干涉质粒(pSilencer-4.1-FUT1SiRNA)和重组FUT4干涉质粒(pSilencer-4.1-FUT4SiRNA)，用于抗肿瘤药物应用。 

本发明的技术方案如下： 

1.设计并合成FUT1和FUT4基因的干涉序列 

应用DNASTAR软件分析了GenBank中全部的人的FUT1/FUT4基因的同源序列，FUT1/FUT4基因的编码序列的全长分别为1098bp和1218bp，从SiRNA设计软件获得的用于抗肿瘤生长的重组FUT1/FUT4的干涉质粒的DNA模板序列中各选取7条作为形成干涉序列的模板DNA序列，长度均为19bp。其中，所设计的FUT1基因的干涉序列为：FUT1-1：TGGCCGGTTTGGTAATCAG；FUT1-2：AGACTTTGCCCTGCTCACA；FUT1-3：GAGGAGTACGCGGACTTGA；FUT1-4：CAGATCCGCAGAGAGTTCA；FUT1-5：CGGCATGGAGTGGTGTAAA；FUT1-6：TGGCCTTCCTGCTAGTCTG；FUT1-7：TTCGCCTTTCCTCCCCTGC。这些序列在FUT1基因中的位置如图1所示。所设计的FUT4基因的干涉序列为：FUT4-1：GCCTGGCAAGTAACCTCTT；FUT4-2：GTAACCTCTTCAACTGGAC；FUT4-3：CGGACGTCTTTGTGCCTTA；FUT4-4：CATGTGACCGTGGACGTGT；FUT4-5：GTTCTACCTGGCTTTCGAG；FUT4-6：CTCGTACCTGCTTTTCCTC；FUT4-7：GCGGAGGCAGCGCTGCCTG。这些序列在FUT4基因中的位置如图2所示。 

2.构建重组FUT1干涉质粒和构建重组FUT4干涉质粒 

①根据SiRNA设计软件获得用于抗肿瘤生长的重组FUT1/FUT4的干涉质粒的DNA模板序列，它是以上述FUT1/FUT4基因的调控区和编码区的序列进行干涉质粒的构建。 

②根据pSilencer-4.1-CMV-neo(Ambion，Inc)载体结构信息设计插入载体的FUT1/FUT4干涉质粒的DNA模板序列，即以干涉载体的多克隆酶切位点(HindIII、BamH I)为基础，设计与干涉载体有相同粘性末端的FUT1/FUT4SiRNA模板的DNA序列，分别构建7个FUT1干涉质粒：pSilencer-4.1-FUT1-1/FUT1-2/FUT1-3/FUT1-4/FUT1-5/FUT1-6/FUT1-7；7个FUT4的干涉质粒： pSilencer-4.1-FUT4-1/FUT4-2/FUT4-3/FUT4-4/FUT4-5/FUT4-6/FUT4-7。每条链的5`末端含有HindIII或BamH I的酶切位点(下划线标出)。具体序列如下： 

FUT1-1(5’-3’) 

GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGA