[发明专利]携带融合蛋白基因的重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种人癌胚抗原576-669(CEA_576-669)和热休克蛋白70样分子1(hsp70L1)融合基因的重组腺病毒及其制备方法和应用。

背景技术

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核及真核生物中的一类蛋白质，在细胞受到应激后表达增加。HSP在细胞内作为伴侣分子，参与抗原的加工和形成MHC-抗原肽复合物。

近年来，HSP家族明显的佐剂样作用引起了国内外学术界的关注。研究表明，HSP在细胞受到应激后，可以释放到细胞外，诱导抗原提呈细胞和T细胞成熟活化等重要的生理过程，因此与机体的抗肿瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理机制密切相关，是一类重要的免疫分子(Srivastava PK，Annu Rev Immunol.2002；20：395 425)。

热休克蛋白家族按照分子量可以分为四类：Hsp90家族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子Hsp家族，其中Hsp70家族是HSP中最保守和最主要的一类。许多研究表明，肿瘤细胞或者病毒感染细胞来源的Hsp70-肽复合物、Hsp70分子联合多肽抗原、或者与多肽抗原交联的复合物，能够明显诱导产生抗原特异性的CD8⁺的CTL，单独使用Hsp70或者单独应用多肽抗原则无此效应，因此HSP在抗原递呈过程中的佐剂样作用及小分子肽的免疫原性是HSP介导的免疫治疗所不可缺少的两个重要部分(Todryk SM等，Immunology.2003；110：1-9；Manjili MH等，Expert Opin Biol Ther.2004；4：363-373；Blachere NE等，J ImmunotherEmphasis Tumor Immunol.1993；14：352-356；Li Z等，Behring Inst Mitt.1994；94：37-47；Moroi Y等，Proc Natl Acad Sci USA.2000；97：348590)。

HSP诱导的特异性CTL反应是由于专职抗原递呈细胞(APC)上存在HSP的受体，可以使APC特异性地通过HSP受体介导抗原肽的内吞(Arnold-Schild D等，J Immunol.1999；162：3757-3760)；HSP结合的抗原在胞内是通过TAP依赖及TAP非依赖途径，被递呈到MHC-I类分子上，并诱导随后的CTL反应，这种受体被证明存在于DC、巨噬细胞及B细胞等APC上，而不存在于T细胞上(Castellino F，J Exp Med.2000；191：1957-1964)；因此可以认为，HSP通过HSP受体与APC相互作用是HSP作为佐剂的一个重要机理。研究表明，这种受体介导的抗原递呈方式的效率比吞噬高10000倍。

HSP70分子在胞外可以行使类似细胞因子样作用。HSP70可与单核细胞产生高亲和力的结合，诱导其产生IL-6、IL-1等活性细胞因子，并可以诱导DC成熟，上调其MHC-II和CD86分子表达，分泌IL-12和TNF-α，从而增强DC的抗原递呈能力(Svensson PA等；Atherosclerosis.2006；185：32-38)。因此，采用HSP作为免疫佐剂协同肿瘤抗原诱导DC，可以靶向性介导抗原的递呈，增强抗原的递呈效率，从而诱导更强的CTL反应。

在明确了HSP的独特佐剂效应的基础上，利用HSP的佐剂作用诱导抗肿瘤和抗感染免疫因此成为热点，基于HSP的新一代疫苗纷纷进入临床试验研究。基于HSP的疫苗构成概括起来主要有以下几种方式：1、从肿瘤细胞或病毒感染细胞纯化HSP-肽复合物，用纯化的HSP-肽复合物体内免疫激发抗肿瘤或抗感染免疫。HSP肽复合物用于肿瘤治疗具有明显的优势，因为提取的HSP肽复合物可以直接用于免疫治疗，不需要鉴定其中所包含的肿瘤特异性抗原表位。不足的是，此方案多采用个体化治疗方案，即免疫所用的HSP-肽复合物需要来源于自体肿瘤细胞。2、通过原核和真核表达得到HSP，通过体外交联使合成的表位肽结合于HSP肽结合袋，再用交联的HSP-肽复合物诱导抗肿瘤或抗感染免疫。3、HSP抗原的融合蛋白免疫。4、HSP抗原基因融合表达的DNA疫苗或腺病毒疫苗。