[发明专利]发酵乳酸杆菌的荧光定量PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)的荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

酸性罐头食品(pH 4.5以下)，在其中存活的微生物多为耐酸、抗热性极强的杆菌、球菌等，它们的存在通常会引起罐头的腐败。由于酸性罐头食品提供的酸性环境，其中通常是以喜欢酸性环境的乳酸菌为优势菌群，发酵乳酸杆菌是其中的一种。发酵乳酸杆菌目前常用的检测方法是厌氧平板培养法，待生长出菌落后用肉眼观察挑选可疑菌落，然后进行革兰氏染色和生化鉴定。发酵乳酸杆菌营养要求复杂，培养特性比较特殊，而且传统平板培养生长缓慢，分离培养鉴定周期约需7～9d，因此建立快速检测和鉴定发酵乳酸杆菌的检验方法势在必行。荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术。该技术在PCR反应体系中引入了荧光标记的探针，具有高灵敏性、特异性和精确性的特点。荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，有效解决了PCR污染和对模板定量不准确的问题。目前，该技术已广泛应用于食源性微生物检测领域。然而，迄今国内还未见有利于荧光定量PCR方法快速检测发酵乳酸杆菌的报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测发酵乳酸杆菌的荧光定量PCR方法。

本发明的技术解决方案是：一种快速检测发酵乳酸杆菌的方法，其特征在于有如下步骤：

首先提取待测样品分离琼脂平板上可疑菌落纯培养的基因组DNA并稀释备用。

然后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg²⁺ 1.5mmol/L；Tag酶1u；UNG酶1u；dNTP 0.1mmol/L；发酵乳酸杆菌特异性引物、探针各10pmol；最后加ddH₂O至25μl；设置荧光定量PCR仪的程序参数为：37℃2min；95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火40s，同时收集FAM荧光，40个循环；4℃保存。

其中发酵乳酸杆菌特异性引物为：

L.fermenF-1：5’-CGTCGTTGACGAATACATCC-3’；

L.fermenR-2：5’-TCGATACGACCAGAAGCAAC-3’。

特异性探针为：

L.fermenF-3：5’-FAM-CAAGCCATTCATGATGCCTGTCG-3’。

荧光定量PCR反应结束后，发酵乳酸杆菌能形成典型的“S”型扩增曲线，且Ct值＜35。

本发明提供了扩增发酵乳酸杆菌的特异引物L.fermenF-1、L.fermenR-2和探针L.fermenF-3，从而提供一种快速检测发酵乳酸杆菌的方法，同现有技术相比具有如下优点：

1.检测速度快，直接利用分离琼脂平板上可疑菌落纯培养的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色和生化鉴定步骤，而生化鉴定一般需要24～72h。

2.成本低，由于省略了革兰氏染色和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色和生化试剂的费用，降低了检测成本。

3.灵敏度高，由于该技术在PCR反应体系中引入了荧光标记的探针，提高了检测的灵敏度。

具体实施方式

首先无菌操作取25g待测样品，充分剪碎，加入盛有225ml灭菌生理盐水的灭菌容器内，进行10倍系列稀释后，选择2个～3个适当稀释度，各以0.1mL涂布到MRS琼脂平板上，36℃±1℃，兼性厌氧条件下培养48h。挑取3个或以上可疑菌落，接种于MRS琼脂平板上进行纯培养，36℃±1℃，兼性厌氧条件下培养48h，提取基因组DNA并稀释备用。

然后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg²⁺ 1.5mmol/L；Tag酶1u；UNG酶1u；dNTP 0.1mmol/L；发酵乳酸杆菌特异性引物、探针各10pmol；最后加ddH₂O至25μl；设置荧光定量PCR仪的程序参数为：37℃2min；95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火40s，同时收集FAM荧光，40个循环；4℃保存。

其中发酵乳酸杆菌特异性引物为：

L.fermenF-1：5’-CGTCGTTGACGAATACATCC-3’；