[发明专利]一种快速的稚幼鱼甾类激素提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类甾类激素的提取技术。

背景技术

甾类激素是化学结构相似的亲脂性小分子，主要包括：雌性激素、雄性激素、皮质甾类激素等。它们相对不溶于水，很容易穿过靶细胞的质膜进入细胞内，与细胞质和细胞核中的受体结合形成激素-受体复合物，调节基因表达，并影响特殊组织的生长与分化。在鱼类中，通过检测其各组甾类激素的水平能研究鱼类的生长发育及其调控机制，同时还能研究外界环境对鱼类自身生长发育的影响。

目前，对于成鱼来说，由于其能取得的血清量较多，因而是甾类激素测定的主要对象。而个体较小的鱼类以及稚幼鱼中血清含量少，很难进行甾类激素的研究与分析。有关鱼类稚幼鱼中甾类激素水平的测定和调控机制研究国内尚未见到报道，而国外也仅见到通过乙醚抽提的方法测定夏牙鲆和虾虎鱼幼鱼中雌二醇含量的报道。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供了一种简单快捷的稚幼鱼甾类激素提取方法。

本发明的技术方案将稚幼鱼组织破碎，再利用乙醇和二氯甲烷将其溶解，具体步骤如下：

步骤1、取新鲜的或-20℃冻存的稚幼鱼，称量后剪碎置于研钵中；

步骤2、按照每克鱼重对应1ml 50％乙醇的比例向研钵中加入50％乙醇，充分研磨后将匀浆液转入离心管中；再用上述50％乙醇体积2倍的无水乙醇冲洗研钵中残留的鱼组织，并一同转入离心管中；

步骤3、匀浆采用超声波粉碎15～25秒；并在4℃下，6000～8000转/分钟离心10分钟，收集上清液；

步骤4、将固相残余物与50％乙醇混匀洗涤一次，50％乙醇洗涤用量为每克鱼重应用1ml，再于4℃下，6000～8000转/分钟离心10分钟，收集上清液；

步骤5、将上述两步骤中的上清液汇集，加入上清液5倍体积的二氯甲烷，反复混匀，然后静止分层；

步骤6、用注射器吸除上层的水相，将含有机相的离心管置于通风橱中，45℃水浴，充分挥发有机相；用含有1％BSA的PBS缓冲液充分溶解，并放置于-20℃保持待用。

本发明根据甾类激素的理化性质，设计出快捷的甾类激素提取方法，经反复实验证明，本发明可获得高质量的甾类激素用于研究分析，并经过放射性免疫法(RIA)、化学发光法和免疫酶联法(ELISA)等测定出多种鱼类稚幼鱼中的甾类激素含量。本发明流程简单，操作简单，整个操作过程费时少，结果稳定可靠，无须特殊或昂贵的仪器，成本低，所需试剂少，并且均为无毒或低毒试剂，对操作人员伤害少。本发明可以用于鱼类中稚幼鱼甾类激素的提取，也适用于其它水产生物生长发育及神经内分泌调控研究，具有广泛的适用性。

具体实施方式

实施例1

1)取新鲜的大菱鲆稚鱼(全长1.1cm，0.10g)，称量后置于研钵中剪碎；

2)向研钵中加入0.1ml 50％乙醇，充分研磨后将匀浆液转入离心管中；再用0.2ml无水乙醇冲洗研钵中残留的鱼组织，并一同转入离心管中；

3)匀浆采用超声波粉碎15秒；并在4℃下，6000转/分钟离心10分钟，收集上清液；

4)将固相残余物用0.1ml的50％乙醇混匀洗涤一次，再于4℃下，6000转/分钟离心10分钟，收集上清液；

5)将上述两步中的上清液汇集，加入2ml二氯甲烷，反复混匀，然后静止分层；

6)用注射器吸除上层的水相，将含有机相的离心管置于通风橱中，45℃水浴，充分挥发有机相；用含有1％BSA的PBS(pH 7.4)缓冲液0.5ml充分溶解，并放置于-20℃保持待用。

本方法提取的样品采用北方生物技术研究所的睾酮放免试剂盒，经放免法测定其睾酮含量为0.301ng/g。

实施例2

1)取冷冻保存的牙鲆幼鱼(全长5.8cm，2.10g)，称量后置于研钵中剪碎；

2)向研钵中加入2.1ml 50％乙醇，充分研磨后将匀浆液转入离心管中；再用4.2ml无水乙醇冲洗研钵中残留的鱼组织，并一同转入离心管中；

3)匀浆采用超声波粉碎25秒；并在4℃下，6000转/分钟离心10分钟，收集上清液；

4)将固相残余物用2.1ml的50％乙醇混匀洗涤一次，再于4℃下，6000转/分钟离心10分钟，收集上清液；

5)将上述两步中的上清液汇集，加入42ml二氯甲烷，反复混匀，然后静止分层；

6)用注射器吸除上层的水相，将含有机相的离心管置于通风橱中，45℃水浴，充分挥发有机相；用含有1％BSA的PBS(pH 7.4)缓冲液1.0ml充分溶解，并放置于-20℃保持待用。