[发明专利]一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆异黄酮的制备方法，尤其是公开了一种利用乳酸乳球菌工程 菌发酵生产大豆异黄酮的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

大豆异黄酮的英文名是Soybean Isoflavones它是从天然植物大豆中提取的一种生 物活性物质，主要分布在大豆种皮、胚轴、子叶中。是一类具有营养学价值和治疗意 义的非固醇类物质，大豆异黄酮具有多种生理功能，不仅参与调节植物的生长活动，还能 对人体发挥有益的生理调节作用。近几年研究发现大豆异黄酮对多种疾病包括肿瘤、 心血管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗起着重要的作用。现在已知的异 黄酮有12种。可分为三类：染料木黄酮(genistein)、黄豆苷元(daidzein)、黄豆黄素 (glycitein)，以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种 形式存在，以异黄酮葡萄糖苷和丙二酰基异黄酮葡萄糖苷为主要形式，共占异黄酮总 量的95％-98％；而游离型异黄酮(苷元)的含量很低。大豆异黄酮的苷元形式要比糖 苷形式活性要高，特别是染料木黄酮的活性更高。染料木黄酮是大豆异常黄酮中的主 要活性因子，因此，染料木黄酮是衡量大豆异黄酮产品中最有效的功能成分，作为检 测大豆异黄酮的含量标准。

目前，工业上生产大豆异黄酮主要是以大豆作为原料提取，由于大豆异黄酮的市 场潜力越来越大，而自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，在含量最高的大豆中所含 的大豆异黄酮也仅为0.1％-0.5％，很大程度的限制了大豆异黄酮的市场开发，也很难满 足日益增大的市场需求。

明内容：

本发明提供一种利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，解决了以大 豆作为原料提取异黄酮方法其异黄酮含量低的缺欠。

本发明还提供了一种食品级乳酸乳球菌工程菌菌株，用于发酵生产大豆异黄酮。

本发明利用乳酸乳球菌工程菌发酵生产大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：

1)设计引物根据GenBank已发表的大豆异黄酮合成酶基因IFS1的DNA序列， 应用PrimerPremier5.0设计引物引物如下(斜体部分为加入的酶切位点)：

上游引物：5′TT ACTAGT ATGTTGCTTGAACTTGCACTTGGTTTG  3′(SpeI)

下游引物：5′TT TCTAGA TTAAGAAAGGAGTTTAGATGCAACGCCG 3′(XbaI)

2)提取大豆吉农17的总RNA，反转录成CDNA；

3)扩增大豆异黄酮合成酶基因IFS1，构建重组克隆载体pMD18-T-IFS1并进行鉴 定；

4)构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFS1，利用电穿孔方法将重组 表达载体pNZ8149-IFS1转入到乳酸乳球菌NZ3900中，获得重组乳酸乳球菌工程菌 NZ3900/pNZ8149-IFS1并进行鉴定；

5)提取乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1的粗蛋白，利用SDS-PAGE方 法对乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1进行蛋白检测；

6)以大豆异黄酮之一染料木黄酮作为标准品，利用高效液相方法检测工程菌发酵 生产大豆异黄酮：

利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/pNZ8149-IFS1发酵柚皮素产生大豆异黄酮；也可 以应用含有柚皮素的自然添加物作为底物利用乳酸乳球菌工程菌NZ3900/ pNZ8149-IFS1发酵生产大豆异黄酮。

本发明涉及的乳酸乳球菌工程菌，是通过以下方法得到的：

构建含有IFS1基因的重组表达载体为pNZ8149-IFS1，利用电穿孔方法将重组表 达载体pNZ8149-IFS1转入到乳酸乳球菌NZ3900即得。

本发明克隆的大豆异黄酮合成酶基因IFS1，来源于大豆吉农17CDNA。是大豆异 黄酮合成途径中的关键酶，属于I型大豆异黄酮成酶基因，在代谢途径中大豆异黄酮 合成酶利用柚皮素(Naringenin)特异的催化产生大豆异黄酮的重要活性成分染料木黄 酮。

本发明选用NICE(NISIN controlled gene expression system)表达系统，本发明 选用的NZ3900/pNZ8149是近年来国际上先进的乳酸乳球菌食品级表达系统。