[发明专利]酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物活性物提取分离技术，尤其涉及一种酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法。

背景技术

近年，多肽蛋白质的研究进展迅速，尤其是具有生理和药物活性的天然多肽和蛋白质，目前已有为数不少的新成分被发现，它们不仅在调节机体功能上发挥重要的作用，而且在抗爱滋病、癌症、心脑血管等疾病上也具有活性。银杏白果不仅含有黄酮、萜内酯、多糖、微量元素，油脂。而且含有10％以上的蛋白质。国外学者发现白果中有动力精样物质核糖核酸酶，邓乾春等人从银杏白果中分离白果活性蛋白((Ginkgo Albumin Protein，GAP)。GAP是以清蛋白为主且具有显著生物活性的蛋白；谢笔钧研究了白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性、抑制肿瘤活性及其免疫功能调节作用。研究表明白果肽段较酶解前的活性蛋白，其抗氧化活性有不同程度的提高，然而目前国内外的相关研究还极不深入，尤其是活性蛋白的高效提取分离及其生物转化活性多肽的加工技术。

植物蛋白质占世界蛋白供应总量的70％以上，其营养价值与动物蛋白质接近，且胆固醇含量低，含有大量人体必需氨基酸，是人类食用蛋白质重要来源。但蛋白质以大分子的形式存在，其氨基酸单体的数量大于100，其中不含各种分子量较少的小肽，因此不利于人体吸收。植物蛋白资源扩大应用的出路在于利用生物方法或酸碱化学方法对植物蛋白进行加工处理，以降低其分子量，同时去除抗营养因子及毒素，改善营养价值与功能特性，提高溶解性能，使其生物效价接近动物蛋白质，代替部分动物蛋白质，达到充分利用植物蛋白资源的目的。

蛋白质水解可转化为多肽，目前主要采用酸法水解和酶法水解。酸法因水解程度不易控制、生产条件苛刻、氨基酸受到损害而很少采用；酶法水解不损害氨基酸而大多被采用，但酶的选择至关重要。因此，利用生物酶法降解活性蛋白，制备活性多肽及氨基酸等生物活性物质，食入人体后，具有降低胆固醇作用，亦有利于肠道内的乳酸菌、双岐菌的生长，具有很高营养价值与功能特性，该法被广泛运用且成为研究热点，尤其是多肽、蛋白类药物脂质体产业化发展迅速，如Berna Biotech公司采用Virosome技术，在脂质体的磷脂双分子层上嵌入病毒膜蛋白，制备脂质体疫苗。

发明内容

本发明提供一种高转化率的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法法，所得到的多肽纯度高。

本发明采用如下技术方案：

一种酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，由以下步骤组成：

第一步，制备脱脂白果粉：将新鲜白果去壳，除衣皮，用打浆机在低于20℃的温度下打浆成膏状，然后用非极性溶剂或超临界CO₂萃取油脂，再在-10℃--50℃冷冻干燥，得到水分的重量百分含量小于5％、破碎，过筛，得到粒度为100～200目的脱脂白果粉；

第二步，酶水解脱脂白果粉：将所述脱脂白果粉和去离子水按质量比为1∶5～1∶15混合，再向其中添加酶，酶的添加质量为所述脱脂白果粉的5％～20％，加热使混合物温度处于30～60℃下，调节使其pH值处于7～10，搅拌反应3～48h，水解后离心分离，收集上清液；

第三步膜分离酶解液，截留分子量为3000-10000道尔顿多肽类活性物，在低于30℃下真空浓缩得到浓缩酶解液；

第四步多肽的纯化：将质量百分数为50～90％的乙醇或丙酮溶液与所述浓缩酶解液按体积比1-10∶1混合搅拌，沉淀多糖类物质，离心过滤制得清液，再加入试剂，所述试剂为三氯乙酸、丙酮、(NH₄)₂SO₄中的任何一种或其混合物，所述试剂与所述清液体积比1-10∶1，并混合搅拌，沉淀得到多肽类活性物；

第五步白果多肽粉的制备∶将第四步得到的所述多肽类活性物，依次用丙酮、乙醇、甲醇洗涤得到沉淀，沉淀在-10℃--50℃冷冻干燥，得到白果多肽粉。

上述技术方案中，多肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽的质量百分含量为50～80％，所含水分的质量百分含量低于5％，粒度100～200目；其中多肽中赖氨酸含量大于7％，组氨酸大于8％，丝氨酸大于11％，天冬氨酸大于14％，谷氨酸大于16％。

酶为活性大于80万u/g的木瓜蛋白酶，活性大于20万u/g的枯草杆菌碱性蛋白酶，活性大于15万u/g的中性蛋白酶、活性大于100万u/g的纤维素酶、活性大于80万u/g的果胶酶中的一种或一种以上的混合物。