[发明专利]具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶L20A及其突变方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶及 其突变方法，以及利用该突变体酶生产D-塔格糖的技术，属于生物工程、基因 工程和酶工程技术领域。

背景技术

D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖 属于天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶 酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格 糖为普遍公认安全食品(GRAS)，并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及 医药制剂中；随后联合国粮农组织和世界卫生组织的联合食品添加剂委员会第 57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧 洲上市。

目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较 为深入，方法主要有两种：化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化 学法生产的。由于一方面化学法生产存在许多不利因素，如化学污染物多，碱 性条件下异构化反应副产物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的 转变，天然食品的需求日益增长，因此近年来对D-塔格糖生产的研究集中在生 物法上。

研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，缩写为L-AI)可以催化D-半乳糖 转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。但是L-AI是一 种非专一性酶，它可以分别催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖为L-核酮糖和D-塔格糖。 研究表明L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明显高于D-半乳糖。本发明所使用的来源 于(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-AI酶是一种高耐热性酶，具有 工业应用前景。因此，进一步提高该酶催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖的能力 将赋予其更好的应用潜能。

发明内容

本发明的一个目的是：提供提高来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-AI酶产D-塔格糖能力的方案。

本发明的另一个目的是：提出具有更高生产D-塔格糖能力的单突变体酶 L20A，及其构建方法。

同时本发明还提供了一种利用该单突变体酶L20A生产D-塔格糖的方法。

本发明的技术方案：一种L-可拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A，将来源于 解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖异构酶 L-AI酶(其基因序列详见Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-009-2322-z)，进行突变所得的单突变体酶L20A；其为L-AI酶 基因中第20位的亮氨酸Leu突变成了丙氨酸Ala，命名为L20A；它相比于野生 型L-AI酶具有更高的产D-塔格糖的能力。

所述的L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A的制备方法，根据ATCC 43068的L-AI酶基因序列，设计突变引物，对L-AI酶进行定点突变，测定DNA 序列，鉴定出第20位Leu密码子突变成Ala密码子，并将其表达于大肠杆菌中， 经诱导即得L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A；步骤为：

(1)定点突变

利用重叠延伸PCR技术，以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版，经 PCR1，PCR2及PCR3，引入L20A突变点，定点突变的引物为：

上游外侧引物：5’-TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3’，

下游外侧引物：5’-TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3’，

正向突变引物：5’-CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3’，下划线为突变碱基，

反向突变引物：5’-CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3’，下划线为突变碱基，

PCR1反应体系为：10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，10μM上游外侧 引物1μL，10μM反向突变引物1μL，模版DNA 1μL，5U/mL taq plus 0.5μL， 加入双蒸水至50μL。