[发明专利]一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体为可对靶标DNA进行缺失、突变和插入外源DNA片段，一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒。

背景技术

DNA重组技术自从20世纪70年代初期问世以来，经过了近40年的发展历程，无论是在基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面，都已经取得了惊人的成绩。DNA重组技术不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化，同时也有力地促进了医学科学研究的发展，在疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、新型疫苗的研制以及癌症和艾滋病的研究等诸多科学均已取得了相当的成就。

然而，利用限制性内切酶和连接酶为主要工具的传统DNA重组技术，很难对像BAC文库这样的大分子DNA进行修饰。传统DNA重组技术中，大多要求DNA片段上存在单一的限制性内切酶位点，而在大分子DNA中一般的内切酶都存在多个位点。另外，大分子DNA的体外操作困难、易断裂，连接、转化效率也随DNA片段长度的增加而下降。

如果可以在细菌体内完成DNA重组操作，将可以解决以上传统DNA重组技术中存在的不足之处。研究发现，来自发光杆菌(Photorhabdusluminescens)的重组酶——Plu2935和Plu2936可以在细菌体内协同作用，完成DNA分子之间的重组。Plu2936为5’-3’核酸外切酶，Plu2935为单链DNA退火蛋白。在进行DNA重组时，Plu2936与双链线性DNA片段结合并按5’-3’方向降解DNA单链，在另外一条DNA链上产生3’突出端。接着，Plu2935便与DNA 3’突出端结合，形成蛋白-DNA复合体。在受体DNA进行复制时，蛋白-DNA复合体寻找同源序列的DNA并退火，新成新的DNA分子。在Plu2935和Plu293重组酶的配合作用下，带有短同源臂(35～50bp)的供体DNA分子可以在体内重组到受体DNA分子的同源区域上，从而实现对DNA分子的替换、插入、删除、突变等多种修饰。该重组酶体系对靶标DNA分子的大小没有限制，不受内切酶位点的限制，不需要体外链接和转化过程，可以对各种大小DNA分子进行操作，尤其DNA大分子修饰方面具有独特的优势。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于：提供一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，以解决背景技术中的问题。

一种快速高效DNA重组的方法包括以下两步：

1.引物设计与PCR扩增

因为Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列。PCR扩增的条件一般为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是1min/1kb DNA)，30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物。因为模板DNA可能会被转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难。引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降。

2.DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞

将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL-REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次。在电击杯中加入1mL复苏液(SOC培养基，0.1mM的MgCl₂溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。

一种快速高效DNA重组的试剂盒，本发明在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达来自发光杆菌的重组酶基因——plu2935和plu2936，利用重组酶Plu2935和Plu2936共同作用，在不需要体外酶切、链接的情况下完成DNA重组，达到快速、高效修饰DNA的目的，由表达重组酶的感受态细胞、对照感受态细胞、标准样品、复苏液组成。