[发明专利]一种预测冠心病易感性的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种预测冠心病(coronary artery disease，CAD)易感性的方法，具体说是通过测定人二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)基因多态性位点-396D/I来预测人群对于冠心病的易感性，该方法可以用于疾病的辅助诊断、治疗、和新药研发，属于医学生物技术和基因诊断领域。

背景技术

近年来，冠心病在我国的发病率和死亡率呈迅速上升趋势，已经成为我国居民死因构成中上升最快并威胁我国公众健康的重要疾病。传统的危险因素如高血压，糖尿病，超重与肥胖，吸烟与饮酒，高脂血症等能致动脉粥样硬化，但很多冠心病患者并无上述危险因素存在或者在上述危险因素控制较好的情况下仍然有心血管事件发生，这表明遗传因素和(或)环境因素可能参与了心血管事件的发生。

从事心血管领域的研究人员都熟知血管壁内皮功能紊乱引起动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多种心脑血管疾病病理生理基础，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS )催化L-精氨酸转化成一氧化氮(nitric oxide，NO)，是内皮细胞合成的一种重要的血管活性因子，具有舒张血管、抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附、抑制平滑肌细胞增殖、减少氧自由基产生及抑制低密度脂蛋白氧化等多种生理效应。ADMA能与L-精氨酸竞争性结合一氧化氮合酶(NOS)，抑制其活性，减少一氧化氮(NO)合成，降低NO的生理效应。ADMA代谢可通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)水解。DDAH分两型：DDAH1和DDAH2。DDAH1主要分布于nNOS表达占优势的组织中，据推测在许多组织中DDAH1是调节血浆ADMA浓度的关键酶，如果其功能受损导致ADMA聚集，NO产生减少，会引起血管内皮受损，体循环血管阻力增加，肺动脉高压等多种病理状态的发生，增加心脑血管事件发生的危险性。

DDAH1具有重要的生物学效应，其基因的遗传变异会影响DDAH1的表达，结构和功能改变，使个体对心脑血管疾病如冠心病的易感性发生改变。其中位于DDAH1基因启动子区-396位四个核苷酸(GCGT)插入的I/I基因型和没有四核苷酸插入的D/D基因型对该基因转录有很大的差别，从而能对冠心病的易感性产生不同的影响。

通过实验我们首次发现并证明我国汉族人在冠心病形成组中的I/I基因型频率较正常人高，对冠心病有致病效应，在校正多重心脑血管危险因子后，DDAH1 I/I基因型是冠心病的一个独立危险因素。

目前进行冠心病的遗传病因研究中，一般采用单核苷酸多态性(SNP)作为基因组标志的关联分析方法是有效的，但传统的PCR-酶切分析SNP的方法存在时间长、可重复性差、灵敏度低、准确率低等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种Taqman探针法进行基因分型，通过非条件logistic回归模型来准确预测冠心病易感性的方法。

本发明的第二个目的是提供一种预测冠心病易感性的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测冠心病易感性的方法，该方法通过提取人的外周血白细胞基因组DNA，测定受试者的DDAH1基因-396位点的基因型，通过非条件logistic回归模型来预测受试者对冠心病的易感性。具体步骤：1.提取人外周血白细胞的基因组DNA；2.对于受试者个体中DDAH1基因多态性位点-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通过序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特异性地从上述DNA中扩增出来，并通过序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探针碱基序列来实现对DDAH1基因-396位点不同的基因型的检测；3.将受试者个体的DDAH1基因-396位点的I/I，D/I和D/D基因型引入非条件Logistic回归分析模型中来预测冠心病的发病易感性。

本发明证明，受试者携带DDAH1的-396I/I基因型时，冠心病易感性升高，对冠心病有致病作用。

一组预测冠心病易感性的引物和探针序列(寡核苷酸序列)，能特异性的扩增出DDAH1基因的-396位点的扩增产物，具有序列表SEQ ID 1所示的碱基序列，其中序列表SEQ ID 2和3所示的碱基序列分别为F引物序列和R引物序列；序列表SEQ ID 4和5所示为Taqman探针混合物，以上寡核苷酸序列在一次检测中同时使用。

一种预测冠心病易感性的试剂盒，由以下试剂组成：