[发明专利]一种聚乙二醇修饰干扰素反应液中回收干扰素的方法

说明书

技术领域

本发明属于聚乙二醇修饰干扰素反应液中的各组分分离纯化领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰干扰素反应液中回收干扰素的方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)由英国科学家Isaacs和LinderMann于1957年发现，是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其中α干扰素临床上主要用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病，也用于一些肿瘤化疗药物的联合用药。

蛋白及多肽类药物的缺陷在于：易被酶水解和被肾脏清除，临床半衰期短，需要多次注射以保持药效浓度。蛋白及多肽经聚乙二醇(PEG)修饰以后，所得蛋白PEG偶联物具有不易被酶水解、免疫原性降低、热稳定性提高以及不易被肾小球代谢等特征。自1977年Abuchowski A等首次将PEG偶联剂用于修饰蛋白质以来，蛋白质PEG修饰技术迅速发展，PEG蛋白药物也陆续上市：已有包括PEG化的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)；PEG化IFNα-2b(PEG-INTRON^TM)；PEG化IFNα-2a(PEGASYS^TM)；PEG化G-CSF(NEULASTA^TM)等40多种PEG化蛋白及多肽药物用于临床治疗，同未修饰的蛋白药物相比较，PEG化蛋白在疗效和安全性等各方面具有极大的治疗优势。

PEG修饰蛋白质过程中，通常以单PEG化IFNα-2b的得率及PEG修饰多聚体和二聚体生成量作为主要考核指标，以对反应条件的进行优化。为了减少PEG修饰多聚体和二聚体的生成，以有利于下游纯化工作，必须控制一定的反应条件，这样就有一定量的游离蛋白未与PEG偶联。根据现有文献记载，在PEG修饰IFNα-2b的反应中，往往约有30％～50％的IFNα-2b未与PEG偶联，而IFNα-2b作为重组蛋白产品，生产条件苛刻，工艺复杂且价格昂贵，因此有必要对未被修饰的IFNα-2b进行回收利用。

目前已有多种层析技术可运用于蛋白质的分离纯化，其中离子交换层析技术是运用最为广泛的一种，其原理在于：混合物中各种分子由于酸碱性、极性、大小以及形状等差异，与层析介质“手臂”通过库伦引力/斥力发生相互作用，其结果是有的组分分子与层析介质“手臂”不吸附或弱吸附，而有的组分分子与层析介质“手臂”强吸附，随后再通过控制洗脱条件，以实现各组分的柱口分离。当介质“手臂”所带电荷为阴离子时，其反离子为阳离子，被称为阳离子交换层析；当介质“手臂”所带电荷为阳离子时，其反离子为阴离子，被称为阴离子交换层析。

蛋白质是由多个氨基酸组成的高分子量化合物，其极性强弱主要取决于组成氨基酸的种类，极性氨基酸(带电荷或不带电荷)的多寡将影响蛋白质的极性，表现为蛋白质亲水或疏水的变化；当蛋白质为亲水性时，所带电荷种类则会影响蛋白质的酸碱性：当所带碱性氨基酸(如Lys、Arg)较多时，蛋白质通常呈碱性；所带酸性氨基酸(Asp、Glu)较多时，蛋白质通常呈酸性。蛋白质的酸碱性可以通过等电点PI来测定，蛋白质PI是蛋白质呈中性时的pH值，即蛋白质净电荷为零时的pH值。当溶液的pH值低于蛋白质PI时，蛋白质带正电荷，可与阳离子交换介质吸附；相反，若当溶液的pH值高于蛋白质PI时，蛋白质带负电荷，可与阴离子交换介质吸附。

蛋白质经PEG修饰以后，与离子交换介质的吸附能力大大降低，PEG分子的屏蔽作用是最主要的原因，线性的PEG分子缠绕在蛋白质周围，使得带电荷残基无法与介质“手臂”靠近。此时，为了保证PEG修饰蛋白的充分吸附，需要将加样缓冲液的pH值更远离PI，当层析介质为阳离子型时，可降低加样缓冲液的pH以使残基质子化程度提高，增加蛋白质正电荷数目，加强蛋白与介质的吸附能力；同样，层析介质为阴离子型时，可增加加样缓冲液的pH以使残基去质子化程度提高，增加蛋白质负电荷数目。

基于以上理论，采用常规方法(姜忠义，高蓉，许松伟等，药物蛋白的聚乙二醇修饰，中国药学杂志；37(6)：409～414)纯化PEG修饰蛋白时，一般用低pH或高pH缓冲液稀释反应液，将稀释液上阳离子或阴离子交换柱，使PEG修饰蛋白及未修饰蛋白均被吸附，利用二者吸附能力的差异，采用NaCl浓度梯度洗脱方式，以获取PEG修饰蛋白。