[发明专利]一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种寡聚半乳糖醛酸的制备方法，尤其涉及一种采用强碱性阴离子交换树脂为填料，以梯度洗脱的方式分离果胶寡糖混合物得到聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸的方法。

背景技术

果胶寡糖是指果胶经化学法或酶法降解得到的一类由2～20个单糖单元组成的低聚糖。近年来研究表明，果胶寡糖，尤其是寡聚半乳糖醛酸具有多种生物活性，可以作为植物防御反应的诱导因子，诱导植物的抗性反应；可用作双歧杆菌增殖因子，高效、专一的促进双歧杆菌生长，改善菌群结构；另外，在控制棉花黄萎病、苹果花叶病、辣椒病毒病等方面效果显著。

寡糖的分离和纯化是寡糖结构与活性研究至关重要的环节。从酶法或化学法降解后的果胶寡糖混合物中分离制备纯度高的单体果胶寡糖对于研究果胶结构及这些寡糖在植物体中所产生的生物活性的的机理有重要的意义。但是由于果胶多糖自身在组成、连接、衍生化、微观不均一性等方面的高度复杂性及其检测上的困难，使得果胶寡糖混合物的分离工作一度进展缓慢。因此，选择合适的方法对混合糖链进行分离，是一项很有意义的工作。

各种分析技术如薄层色谱，毛细管电泳，高效液相色谱等都应用于分离寡聚半乳糖醛酸。高效液相色谱方法如离子对反相色谱，离子交换色谱，空间排阻色谱等均有文献报道，Thibault(Thibault，J-F.J.Chromatogr.1980.)等通过聚丙烯酰胺凝胶色谱分离得到聚合度达到9的寡聚半乳糖醛酸，Jin and west(Jin，D.F.；West，C.A.Plant Physiol.1984.)通过DEAE Sephadex A-25离子交换色谱柱分离得到寡聚半乳糖醛酸的聚合度达到了11。上述分析型色谱柱得到的分离量仅为μg级。Arland等(Arland T.Hotchkiss Jr，Carbohydrate Research.2001.)采用制备型的CarboPacPA1色谱柱，通过脉冲安培检测器检测分离得到了可达mg级的聚合度为2～20的寡聚半乳糖醛酸。该方法一次上样量少，得到的各个聚合度的寡聚半乳糖醛酸为0.1～0.6mg。国内关于寡聚半乳糖醛酸的分离鲜有报道。

但是上述方法在制备和分离果胶寡糖过程中需要特殊的果胶酶，价格较高的离子交换色谱柱或者制备型高效液相色谱，分离成本高，一次制备量少，分离量低，以上这些分离方法不能经济的制备和分离果胶寡糖。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种成本低廉，简单易行同时又能保证寡聚半乳糖醛酸纯度的从果胶寡糖混合物中制备寡聚半乳糖醛酸的方法。

本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法，其特殊之处在于：所述制备寡聚半乳糖醛酸的方法包括以下步骤：

1)果胶酸的制备；

2)以果胶酸为底物通过酶解制备果胶寡糖混合物；

3)寡聚半乳糖醛酸的制备，其具体实现方式是：

3.1)将强碱性阴离子交换树脂采用碱-酸-碱处理，依次用1～2M氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液浸泡活化1h，水洗至中性后装柱，再用甲酸或乙酸溶液洗至pH小于1.5使树脂转为HCOO^-或CH₃COO^-型，水洗至中性，装柱，得到强碱性阴离子交换树脂柱，备用；

3.2)将步骤2)所得到的果胶寡糖混合物调pH值为6～8，将样品上样至通过步骤3.1)处理得到的强碱性阴离子交换树脂柱；

3.3)用蒸馏水洗脱除去过载的样品和未被树脂交换的杂质；

3.4)用pH 6～7的0.1M～2M甲酸铵或乙酸铵缓冲液进行连续梯度洗脱；

3.5)TLC跟踪监测，收集聚合度相同的组分后减压浓缩，经阳离子交换树脂除盐，冷冻干燥，得到半乳糖醛酸和聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸单体。

上述步骤1)的具体实现方式是：

1.1)将果胶多糖以1％～2％的质量浓度溶于0.5～1M NaOH的50％乙醇溶液中，冰浴搅拌反应5～8h后在0～5℃放置8～12h后抽滤；

1.2)将步骤1.1)抽滤后所得到的沉淀加入上述反应1/2～1/4体积的50％乙醇溶液中，在20～30℃用HCl将pH值调至1～2，保持pH＜2.0继续搅拌30min～2h，抽滤得沉淀；

1.3)在步骤1.2)中得到的沉淀中加入上述同样体积含1％HCl的50％乙醇溶液，室温下搅拌30min～2h抽滤得沉淀，用50％乙醇溶液洗涤沉淀至中性，抽滤得沉淀；

1.4)将步骤1.3)所得到的沉淀复溶于水，冷冻干燥得果胶酸。