[发明专利]致病菌的检测方法

权利要求书

1.致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计并合成具有粘性末端的编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；

2)将编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地连于噬菌体衣壳蛋白的表达调控序列中，形成四半胱氨酸重组噬菌体；

3)用步骤2)中的重组噬菌体侵染宿主细胞，并在其中繁殖，生成带有表达四半胱氨酸重组噬菌体的重组细胞；

4)在重组细胞中加入双砷染料，经洗涤去除非特异性结合后，被重组噬菌体特异识别侵染的细菌，在激发光照射下可发出特异荧光，经流式细胞仪或荧光显微镜进行特异性检测。

2.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP。

3.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指：“TTC CTG AAC TGT TGT CCC GGC TGC TGC ATG GAGCCT”。

4.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述可操作地连于，是指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性；如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。

5.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述可操作地连于，意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

6.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述宿主细胞为原核细胞，是步骤2)中所用噬菌体特异识别的待检测细菌。

7.如权利要求6所述的致病菌的检测方法，其特征在于所述待检测细菌为E.coli BLT5403；E.coli TG1；E.coli O157或salmonella。

8.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤3)中，重组噬菌体侵染宿主细胞时，控制噬菌体和宿主细胞的比例小于1000∶1，侵染繁殖时间为30～90min。

9.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述双砷染料为FLAsH和ReAsH荧光物质中的至少一种，其终浓度为1～10μM，反应时间为30～90min，反应温度为室温。

10.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述洗涤分别用BAL(3-羟基-1，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank′s平衡盐溶液)洗至少1次；在经流式细胞仪或荧光显微镜进行特异性检测前加入HBSS重悬。