[发明专利]二羟基丙酮激酶的原核表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达二羟基丙酮激酶蛋白(DAK)的原核表达载体pET28a-DAK及其在DAK蛋白的原核表达和DAK蛋白抗体制备中的应用。

背景技术：

甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚，被广泛用于工业生产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/立方米)，对新装修住宅的调查结果表明室内空气中甲醛浓度是室外空气的6.65倍，为0.492mg/m³，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。甲醛为较高毒性物质，它反应能力极强，能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。

相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物(VOC)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种：一是使用环保材料；二是开窗通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese等，1994，Plant Physiol.104：1301-1309)。

甲基营养酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代谢机制，在甲醇的代谢途径中，甲醇首先被乙醇氧化酶氧化为甲醛，甲醛是甲醇代谢过程中的一个关键性的中间产物，它处于甲醇同化和异化途径的分支点上。二羟基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途径中的第一个反应，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羟基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲醇被乙醇氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等，2005，The Chemical Record.5：367-375)。通过突变体和酶学特性分析证实了DAS的生理作用是甲醇同化作用的关键酶。目前已从甲基营养型酵母菌假丝酵母(Candida boidinii)中克隆到编码DAS的基因(DHAS1)，进一步的调查结果证实DAS主要参与这种酵母菌细胞中甲醛的同化作用而非异化作用或脱毒作用(Sakai等，1998，American Society for Microbiology.180：5885-5890)。

二羟基丙酮对酵母细胞来说是有毒的化合物，在酵母菌中二羟基丙酮激酶(DAK)参与二羟基丙酮的脱毒作用，它催化的反应使二羟基丙酮磷酸化，形成无毒性的磷酸二羟丙酮，可为酵母细胞所利用。该酶普遍存在于大多数的生物体中，结合遗传学和生物化学方法，已从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆到两个编码DAK的基因(YML070W/DAK1和YML053W/DAK2)，它们所编码的蛋白质是同型二聚体(Molin等，2003，The journal of biological chemistry.278：1415-1423)。从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中克隆到的DAK基因编码的蛋白质定位于细胞质中(Lüers等，Yeast.1998，Jun 15，14(8)：759-71)。