[发明专利]纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法

权利要求书

1.一种纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法，包括：

(一)检测试剂及探针的准备

(1)纳米金溶液的制备

首先，配置浓度为1mM HAuCl4溶液及浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，并将HAuCl4溶液加热至130℃，在加热过程中搅拌充分，20分钟时迅速加入柠檬酸三钠溶液25ml，在加入过程中不使HAuCl4溶液降温，持续搅拌至溶液冷却至室温、形成酒红色溶液，最后用硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，4℃保存备用。

(2)H1N1DNA检测探针的设计及合成

以流感病毒H1N1序列为靶目标基因模板，建立利用未修饰的纳米金复合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析方法，DNA探针序列为：

H1N1 DNA探针：5’-ACGGAAGGAGTGCCAA-3’；

互补的靶H1N1 DNA：5’-TTGGCACTCCTTCCGT-3’；

非互补DNA：5’-AGTAGTGTTGGGTCGC-3’；

(3)聚噻吩衍生物的制备

在检测DNA杂交中，选择阳离子共轭聚合物

[3-(3’-N，N，N-triethylamino-1’-propyloxy)-4-methyl-2，5-thiophene hydrochloride]作颜色指示剂，选择性灵敏地检测单链或双链DNA；

(二)目标靶序列的检测

1.单链或双链DNA杂交溶液制备

取去离子水4.5μL，加入5μL 0.2M NaCl/0.1M pH＝7.4的phosphate buffer、0.25μL 100μM H1N1 DNA探针或0.25μL 100μM非互补的寡核苷酸DNA，充分混匀，制备单链DNA溶液；或另取去离子水4μL，加入5μL的0.2MNaCl/0.1M pH＝7的phosphate buffer、0.5μL 100μM H1N1 DNA探针以及0.5μL100μM完全互补的靶H1N1 DNA，充分混匀，互补的的两个单链DNA经过杂交形成双链的DNA，制备为双链DNA溶液；

2.基于纳米金结合聚噻吩用于互补靶DNA的检测

取两管浓度为12nM纳米金溶液100μL，分别加入非互补的探针单链DNA溶液和序列完全互补双链DNA溶液各1μL，混匀，观察纳米金溶液的颜色；再分别加入浓度为0.05mg/ml 1μl聚噻吩，充分混匀，观察纳米金溶液的变化。

2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(1)中寡核苷酸探针与杂交缓冲液的浓度比为1∶10。

3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(2)中的纳米金颗粒为13nm、纳米金溶液浓度为12nM。

4.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(2)中的DNA探针与聚噻吩衍生物的浓度比为1∶1。

5.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(一)/(1)中使用的硝酸纤维尼龙膜的孔径为0.22μm。

6.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(二)/(2)中的目标靶序列的检测是指以靶H1N1 DNA作为杂交模板。

7.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于纳米金结合聚噻吩衍生物检测灵敏度为49nM。