[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir与Tccp的重组蛋白

说明书

一、技术领域

本发明涉及肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7转位紧密粘附素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(TccP)重组蛋白制备方法及应用，属于生物技术领域。

二、背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7作为一种食源性致病菌被认识已经有20余年的历史，是引起人出血性结肠炎(HC)的主要病原菌，还可在5％～10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可致死亡。近20余年来，EHEC O157:H7引发的食物中毒在世界各地包括我国都有不同规模的暴发流行。目前该菌的感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，受到广泛关注。但对其感染尚无有效防治方法，研究证明抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者并发HUS的危险性增加。目前还没有理想的疫苗可用于EHEC感染的防治，为此，尽快研制出切实有效的能够切断传染源以彻底清除病原菌的有效疫苗成为当前该领域的研究重点。

转位紧密粘附素受体(Translocation intimin receptor，Tir)为O157:H7的转位跨膜衔接蛋白，是紧密素的主要受体，由EHEC O157:H7毒力岛LEE岛上的tir基因编码。该蛋白通过EHEC III型分泌系统(type III Secretion System，TTSS)分泌并转位至宿主细胞中，参与细菌的紧密粘附、肌动蛋白聚合基座形成A/E损伤。Tir全基因为1677bp，编码含559个氨基酸残基，分子量为72kDa的蛋白质。

内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(Tir couple cytoskeleton protein，TccP)是近年来在EHEC O157:H7中新发现并确定的一种毒力因子，由O157:H7基因组内编号为Z3072的开放阅读框序列编码，分子内含有数个富含脯氨酸的重复片段，该重复片段由47个氨基酸残基组成，C末端15个氨基酸也是一个截短的重复片段。不同菌株来源的TccP的重复片段数目不同，由2-8个不等。该蛋白通过III型分泌系统转导进入宿主细胞，在EHEC O157:H7定植感染过程中起重要作用。国际参考菌株EDL933EHEC TccP基因全长1155bp，编码含384个氨基酸残基，分子量为42.5kDa的蛋白质。

三、发现内容

技术问题本发明目的在于表达EHEC O157:H7转位紧密粘附素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(TccP)重组蛋白，研究其免疫原性，进而为研制EHECO157:H7的基因工程亚单位疫苗奠定基础，为更加安全而有效的防控O157:H7感染提供技术手段。

技术方案本发明的具体实施方案如下：

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白(TccP)重组蛋白制备方法与应用，其特征在于，所说的重组蛋白为构建的重组菌BL21(pGEX-4T-1-tir-tccp)所表达。重组蛋白的制备方法包括：

(1)获取tir和tccp基因C端序列，并串联克隆入pGEM-T载体

根据GenBank公布的EHEC O157:H7 EDL933菌株Tir基因序列(AF125993)和TccP序列(NP_288437)分别设计并合成两对特异性引物，以O157:H7 EDL933菌株煮沸制备的DNA为模板，分别扩增tir和tccp基因C端1243bp和825bp序列，引物序列如下：

Tir-P1：5’-tacggatccactcttaacaggcagattgg-3’

Tir-P2：5’-cgaaagcttcgttatcagtagtatccc-3’

TccP-P 1：5’-accaagcttcccattcggcatcatttc-3’

TccP-P2：5’-cggctcgaggcttagatgtattaatgcc-3