[发明专利]利用TAT核心肽段促进外源蛋白可溶性表达的方法及其专用表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术产品应用领域，涉及外源蛋白的大量制备方法，特别涉及种利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的方法及其专用表达载体。

背景技术

众所周知，蛋白质是机体生命活动的重要执行者，也是目前市场上大量使用的蛋白类药物的物质基础。如何实现有功能的、高活性蛋白质的大量制备并进一步显著提升生物制品的生产效率，不仅是生物工程领域亟待解决的问题，而且还是基于蛋白质药物研发领域的一大难题。

TAT(Trans-activator transduction)是HIV-1(Human Immunodeficiency Virus-1)编码的一段富含碱性氨基酸序列的多肽，属于蛋白转导结构域家族的成员，目前的研究揭示该家族主要还包括Antp、HSV VP22和人工合成的多聚精氨酸和多聚赖氨酸等，能够介导多种外源物质如蛋白质、核酸和其他颗粒性物质(如纳米材料)等通过所有生物膜性结构，而不失去外源物质的活性。

根据病毒株的不同，TAT全长含有86-102个氨基酸不等，核心区含有11个氨基酸(YGRKKRRQRRR)。Frankel与Green分别于1988年独立证明全长TAT多肽能够跨膜转导入细胞，激活HIV-LTR的启动子，继而激活后续蛋白的表达(Frankel et al，Cellularuptake of the TAT protein from human immunodeficiency virus.Cell 1988，55(6)：1189-1193；Green et al，Autonomous functional domains of chemicallysynthesized human immunodeficiency virus TAT trans-activator protein.Cell1988，55(6)：1179-1188)；1994年，Fawel等研究进一步揭示TAT具有蛋白转导活性(Fawell et al，TAT-mediated delivery of heterologous proteins into cells.Proc Natl Acad Sci USA 1994，91(2)：664-668)；而Vives等于1997年揭示TAT中 一段富含碱性氨基酸、带正电荷的核心肽段具有蛋白转导活性，后续许多研究都是基于TAT核心区的跨膜转导功能展开(Vives et al，A truncated HIV-1 TAT proteinbasic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulatesin the cell nucleus.J Biol Chem 1997，272(25)：1601016017)。但直到目前为止，所有的研究仅停留在TAT介导外源物质跨膜转导现象的层面，没有资料介绍对TAT多肽其它功能的研究。 

发明内容

本发明提供了一种利用TAT核心肽段(氨基酸序列：序列表中序列3)促进外源蛋白高效、可溶性表达的专用表达载体。

本发明所提供的专用表达载体，是含有一个或多个TAT核心多肽编码区的原核表达载体。

所述TAT核心多肽编码区为能够根据三联体密码组合成其氨基酸序列的任意核酸编码序列，如序列1所示的tayggnmgna araarmgnmg ncarmgnmgn mgn序列，其中y＝a、t、g或c，m＝a、t、g或c，n＝a、t、g或c，r＝a、t、g或c；优选的核苷酸序列可如序列表中序列2所示的tacggcagga agaagcggag acagcgacga aga。

用于构建所述专用表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，如pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30等，优选为pET28。

其中，以pET28为出发载体构建的专用表达载体为pET28b-TAT。

另一方面，用以上所述的专用表达载体构建的带外源基因的原核表达载体也属于本发明。具体的，可以为图2(B)所构建的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP，或图6(B)所构建的原核表达载体pET28b-TAT-NGB。

本发明的第二个目的是提供一种利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的方法。

本发明所提供的利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的方法，可包括以下步骤：