[发明专利]人TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TIM-1Fc的重组表达。

背景技术

初始CD4+Th细胞接受抗原活化后可向至少两种表型与功能不同的细胞亚群 分化：Th1与Th2细胞。它们是免疫调节的核心，Th细胞分化成Th1与Th2受多种 因素的调节，包括抗原的种类与提呈途径、APC类型、细胞因子、转录因子与信号 转导途径以及细胞微环境因素等的综合作用。尽管对Th1与Th2亚群的功能及Th 细胞分化的调节了解很多，但对两者的特异性表面分子知之甚少，为了寻找能够区 分Th1与Th2的细胞表面标志，2002年Monney等发现并鉴定了表达于T细胞的一 个新基因家族TIM(T cell immunoglobulin mucin，TIM)，随后有关TIM的大量发 表在Nature和Science等杂志上，成为T细胞最新研究的热点。

T细胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin mucin，下文简称“TIM”)是新 近发现的表达在T细胞表面与细胞活化相关的重要新分子。研究显示，小鼠TIM基 因家族位于1lb1.1，目前共发现8个基因，包括编码蛋白TIM1～4和4个假想蛋白 TIM5～8。在人类，TIM家族只有3个基因，定位于染色体5q33.2，相应于小鼠的 TIM-1、TIM-3，但没有TIM-2。由于TIM-4为TIM-1的配体表达于树突状细胞表 面，而TIM-3、TIM-1则分别选择性的表达于Th1与Th2细胞，凸现人类TIM家族 中TIM-3、TIM-1在免疫调节中的作用。TIM蛋白是一类具有共同基序的跨膜糖蛋 白，其基本结构包括免疫球蛋白(Ig)样区、粘蛋白样区、跨膜区和有磷酸化位点的 胞内区，其中IgV样区包括4个保守的半胱氨酸，粘蛋白区各成员之间有较大的变 化，但均富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸，粘蛋白区有很多糖基化位点。这些成员胞 内区约含42～77个氨基酸，都包含一个胞内酪氨酸激酶磷酸化基序，为小鼠和人 类同源物中最高度保守的区域。其中TIM-1胞质结构域有含一个高度保守的酪氨酸 激酶磷酸化活化基序；但TIM-3包含一个与其他成员不同的保守性酪氨酸激酶磷酸 化基序，能与胞质中SH2结构域结合，介导的胞内抑制信号。人TIM-1最先被鉴定 为甲型肝炎病毒的细胞受体，它表达在肾脏与肝脏，因此最初克隆时命名为甲肝病 毒细胞受体(hepatitis A virus cellular receptor，HAVcr1)。HAV感染后，可与TIM-1 的自然配体竞争结合在Th2细胞上的TIM-1，从而阻断TIM-1与其配体结合后提供 的向Th2细胞诱导的信号转导，改变T细胞的分化以及Th1细胞与Th2细胞的平衡。 在体内，TIM-1是CD4+T细胞活化必须的共刺激信号，过度表达可引起IL-4的明 显增加；抗TIM-1抗体可以降低IL-13等Th2细胞因子的产生，从而减轻哮喘的症 状。进一步研究人T细胞TIM-1的信号传导发现，TCR/CD3信号所需的ZAP70和 IL-2诱导的T细胞激酶的活化需要TIM-1胞内酪氨酸的磷酸化激活，通过TIM-1 的表达形成PI3K和ITK复合物，活化T细胞的信号传导，提示TIM-1分子及其信 号通路是T细胞介导疾病良好的选择性靶点。

因此，利用TIM-1-Fc重组蛋白阻断T细胞的活化来诱导免疫耐受，对于器官 移植排斥反应的治疗具有重要潜在临床应用价值。

迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业生产蛋白质的 宿主细胞，大肠杆菌的主要优点是：易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大 体积培养可获得高产率的表达产物；比细胞易于培养，从而可降低生产成本。

然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要的 缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓包涵体，即无生物学活性的不溶性聚合体， 必须对包涵体进行变性-溶解-复性处理。这一过程获得的产物回收率很低，也影响 了蛋白质活性；另外，大肠杆菌等原核表达系统无蛋白的糖基化功能，不能满足蛋 白糖基化获得的活性。

发明内容：

本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含 人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头，所述人免疫球蛋 白Fc部分和T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者通过所述接头相连或直接相连。

本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，所述核酸序列选自：

1)编码上述融合蛋白的核酸序列；