[发明专利]牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药技术或生物技术领域，具体涉及牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗产品及制备方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒呈世界性分布，易感动物较多，如鹿、牛、猪、羊等，且它们间可相互传染。该病毒引起的疾病全年均可发生。牛病毒性腹泻病毒可导致动物的病毒性腹泻、粘膜病、流产、死胎、弱胎、畸形胎、持续性感染、免疫耐受、血小板减少和出血性综合症等多种临床症状，还可导致非典型性猪瘟，给鹿业和奶牛业及养猪业造成极大的危害；尤其是在人用的疫苗中发现了该病毒，这对人类是一个潜在的威胁。牛病毒性腹泻病是全球性传染病，具有较高的感染率，流行的范围在不断扩大，阳性率在逐年增高。该病的发生和流行给养殖业造成了重大的经济损失。由于灭活苗，核酸疫苗，亚单位疫苗免疫原性差、保护力低，而活毒疫苗不安全等原因，至今尚无很好的疫苗可供使用，亦无治疗的特效药，因此急需研制有效的疫苗和治疗的特效药。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，用于动物牛病毒性腹泻病防治，克服现有的灭活苗，核酸疫苗免疫原性差、保护力低，活毒疫苗使用不安全的缺点。

本发明是将牛病毒性腹泻病毒保护性抗原基因在可食性的抗病毒的药用植物黄芪宿主中表达得到的疫苗产品。

本发明的牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗是先以牛病毒性腹泻病毒RNA为模板用反转录-聚合酶链式反应法获得E₀基因，再构建牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体，然后采用花粉管通道法，将牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注在处于半开放的黄芪花的柱头上，待黄芪种子成熟时收获种子，种植所收获的种子得到再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，得到牛病毒性腹泻病毒E₀基因转化黄芪，再通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，所得到的疫苗产品。

本发明药用植物疫苗的表达宿主还可以选用人参、鱼腥草、莪术、防风、刺五加。

本发明疫苗的制备方法包括以下步骤：

1、牛病毒性腹泻病毒基因E₀基因的获得

以提取RNA常规方法提取的牛病毒性腹泻病毒基因组RNA为模板，用反转录-聚合酶链式反应法扩增E₀基因。扩增所用的引物序列如下：上游：5′-CCGGATCCACCATGGAAAACATAACACAGTGG-3′；下游：5′-GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3′。反转录-聚合酶链式反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，按维特洁DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的基因E₀

2、牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体构建

分别用DNA限制性内切酶双酶切经凝胶纯化的目的基因E₀及植物表达载体DNA，用T4 DNA连接酶16℃条件下连接16h，取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌工程菌，挑取转化菌单菌落抽提质粒，经聚合酶链式反应鉴定和DNA限制性内切酶双酶切鉴定及序列分析筛选牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体转化的重组工程菌，

3、牛病毒性腹泻病毒基因E₀花粉管通道法转化黄芪

大量培养重组工程菌，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体。选取花多、大而整齐的黄芪，用注射器将1-2ng/μl牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注于半开放的、颜色鲜艳的花的柱头之上，去除已经开放、花色暗淡的花朵以及还未开放的花朵，待种子成熟时收获种子，室温保存。对收获种子种植制备再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，筛选出牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪。

4、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的筛选

对牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪，通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，得本发明疫苗产品，见表1。将牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，移植大田进行扩繁，九月份收获转基因黄芪。

表1酶联免疫吸附法筛选牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗