[发明专利]用于检测EB病毒的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及用于检测爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV，在此简称EB病毒)的引物、试剂盒及方法。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于γ疱疹病毒亚科的成员之一，是人类的一种特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒，一直被认为是人类某些严重疾病以及肿瘤的致病因子，与许多疾病的发生都有着密切的关系，威胁着人类的健康。EBV主要通过人类唾液传播，因此呼吸道是EBV潜伏的最大场所。调查结果显示，世界人口的90％以上都存在EBV的潜伏感染，或成为EBV携带者。更重要的是EBV感染与越来越多的人类恶性肿瘤有关，应用原位杂交证明了携带高拷贝EBV除了能转化淋巴细胞外，也能赋予肿瘤细胞一定的生长优势，使其成为优势细胞群，呈现转化特征。EBV引发了全球癌症的1％，并占所有感染性癌症的5.6％。根据国际癌症研究署对致癌因子的分类标准，EBV被列在第一组致癌因子中。

随着近几年癌症在全球的急剧蔓延，EBV感染的早期检测和预防成为当务之急。目前ELISA检测EBV各项抗体是临床诊断EBV感染的重要指标之一，但它实际上检测的是人体对EBV感染的免疫反应状态，无法检测病毒自身，也就无法准确灵敏地反映EBV感染的情况。由于鼻咽癌外周血循环的游离EBV-DNA的拷贝数随着全身化疗周期的进行而呈现动态变化，所以检测鼻咽癌患者EBV-DNA的表达水平对判断病灶残留、复发、转移、判断治疗的敏感性、综合治疗方案的及时更改、确认以及判断疗效、预后均具有重要的指导意义，EBV目前已经成为鼻咽癌诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一项参考依据。

目前国外已经上市的检测EBV-DNA的试剂盒有几种，检测的方法主要是荧光免疫杂交(HIGH)，国内检测EBV主要采用ELISA方法，未见有批准上市检测EBV-DNA的试剂盒。基于EBV感染情况如此严重，开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种用于检测EB病毒的引物或其组合物。

本发明的另一个目的在于提供上述引物或其组合物在制备用于检测EB病毒的工具中的用途。

本发明的另一个目的在于提供一种用于检测EB病毒的试剂盒。

本发明的又一个目的在于提供一种检测EB病毒的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种用于检测EB病毒的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供了一种用于检测EB病毒的引物组合物，该引物组合物包括上述用于检测EB病毒的引物以及内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

另一方面，本发明提供了上述引物或引物组合物在制备用于检测EB病毒的工具中的用途。

另一方面，本发明提供了一种用于检测EB病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测EB病毒的引物或引物组合物。该试剂盒还可以包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液和核酸洗涤液和PCR反应液。

又一方面，本发明提供了一种检测EB病毒的方法，该方法包括以下步骤：1)提取样本DNA；2)使用上述引物、引物组合物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)得到的扩增产物。步骤1)中的样本优选为人的血液或体液。步骤3)中的检测方法优选为微流体芯片检测法。

在本发明的一个优选实施方案中，通过对患者血液中的DNA进行EBV检测，从而判断患者是否感染了EBV，具体包括以下步骤：

1)提取人临床样本的DNA。

2)将EBV特异性引物和人DNA保守序列特有基因的特异性引物混合，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增，被扩增的目标基因片段大小各不相同。

3)扩增产物通过微流体芯片进行检测。

4)通过各检测峰的位置确定检测到的片段的大小，从而判断被检测到的基因，鉴别临床样本感染的病毒类别。

5)结果判断：a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出来，检测无效；b)只出现DNA内参特异性峰，说明没有EBV感染；c)出现DNA内参和EBV特异性峰，说明有EBV感染。