[发明专利]大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用

说明书

技术领域：

本发明提供一种大绿蛙(Rana livida)抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

在中国的传统中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药材广泛应用，如大蟾蜍(Bufo bufo)，西藏蟾蜍(Bufo tibetanus)，华西雨蛙(Hyla annectans)，棘腹蛙(Rana boulengeri)，斑腿泛树蛙(Polypedates leucomystax)，及花姬蛙(Microhyla pulchra)。其已报道的药理活性和临床疗效包括抗炎、抗肿瘤、局麻、镇痛、免疫调节和心血管调节作用等。由于常以全体入药，再加上其传统炮制方法的局限性，两栖类动物作为传统的中药材其有效成分往往不能很好地发挥作用，从这些传统药物中寻找特定活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。国外从20世纪70年代就开始大规模从两栖类动物尤其是皮肤中寻找具有特定药理活性的单体化合物，这些单体化合物已经成为新药发明的亮点，如广胸蟾素在治疗Sojgren综合症和类似疾病方面能获得满意的结果；来源于非洲爪蟾的抗菌肽Magainin具有很强的抗菌活性且无溶血活性；蛙啡肽具有强大的镇痛和镇静作用，是吗啡的2000倍且无药物耐受性和成瘾性；分别来自蟾蜍和林蛙皮肤的bofokinin和ranakinin具有舒张血管和降压作用；分别来自北美豹蛙和阿伯蛙的亮精肽和酪精肽具有免疫调节和抗肿瘤作用。

自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的原子团或原子，在体内行使能量传递、免疫和信号传导等作用，为机体维持生命活动所必须，但过多的自由基就会具有破坏性，是引起衰老的重要原因之一，常导致生物体正常生物大分子、细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等。机体的许多功能如吞噬、解毒、炎症等都会导致体内过多自由基的产生；此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多自由基。及时清除体内过量的自由基是机体自我防护体系的重要组成部分。

机体具有强大的抗氧化系统。传统的抗氧化系统分为两类：第一类为基因编码的大分子抗氧化酶类如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶等；第二类为一些非基因编码的小分子物质如胡萝卜素和维生素E等。近期从滇蛙皮肤中发现的基因编码并可分泌表达的小分子抗氧化多肽(antioxidant peptides)为一类新型的抗氧化系统。本发明涉及的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL属于此类抗氧化物质，具有快速、强大的自由基清除能力，可以最大限度地保护皮肤，使其尽可能少地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤，对生物医学及化妆品研发具有重要意义。

发明人将本发明的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的大绿蛙抗氧化肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

发明内容：

本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗氧化活性的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

大绿蛙抗氧化肽antioxindin-RL是大绿蛙抗氧化肽基因编码的一种单链多肽，分子量1672.98道尔顿，等电点9.31，大绿蛙抗氧化肽全序列为：丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸-苏氨酸。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因的克隆包括：

大绿蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选大绿蛙抗氧化肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATC 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的基因由306个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

atgttcacca tgaagaaatc cctgttactc ctttttgttc ttggaaccat caacttatct    60