[发明专利]一种利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷 的方法。

背景技术

环磷酸腺苷是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，作为细胞内的第二 信使，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质等的合成调节起着重要的作用。临床上用于治疗 心绞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等 症状有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓 解；此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。环磷酸腺苷也可作 为药物中间体制备二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的 生理及药理作用。环磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的 作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。

环磷酸腺苷的制备方法主要有化学合成法、发酵法、酶促转化法3种。国内外目前 全部采用化学合成法，以腺苷一磷酸为原料，采用高效分离柱进行中间体分离，操作复 杂，溶剂损耗量大，收率低成本高，产量小。发酵法是在含有C、N源的基本培养基上 添加前体物质，通过培养微生物细胞可以获得大量的环磷酸腺苷。但是该方法由于存在 细胞膜透性、氧的传质、环境互适应机制等技术瓶颈，离工业化还有一定的距离。全细 胞生物催化是利用哺乳动物或微生物(节杆菌、液化短杆菌等)来源的环磷酸腺苷合成 酶系来合成环磷酸腺苷。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保 持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此用微生物细胞直接作为酶源进行酶催化 反应，能够迅速有效地完成多步酶催化反应，并且可以省去将酶从微生物细胞中提取出 来的步骤。由于其反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短、无污染等特点越来越 受到研究者的关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可降低成本且操作方便的利用全细胞生物 催化生产环磷酸腺苷的方法。

本发明的思路是：针对酶促反应中酶的活性容易受到损伤的缺陷，可加入多羟基的 有机试剂来保护酶的活性。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又 保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此用微生物细胞直接作为酶源进行酶催 化反应，能够迅速有效地完成多步酶催化反应，并且可以省去将酶从微生物细胞中提取 出来的步骤。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方法，以多羟基有机试剂保护酶的活 性，以环磷酸腺苷前体物质和磷酸根离子为底物，以葡萄糖为能量供体，加入金属离子， 利用有透性的微生物菌株，全细胞催化生产环磷酸腺苷。

其中，所述的多羟基有机试剂为甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨醇、乙 二醇和甘油中的任意一种或几种。

其中，所述的环磷酸前体物质为腺嘌呤、腺苷、腺苷单磷酸、腺苷三磷酸、肌苷、 肌苷酸或次黄嘌呤。

其中，所述的金属离子为镁离子和铵离子中的任意一种或几种。

其中，所述的微生物菌株为节杆菌、微杆菌、液化短杆菌、玫瑰色石蜡节杆菌、大 肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、棒杆菌和产氨短杆菌属中的任意一种。

酵母细胞的使用量为按湿菌体10～1000g/L，优选200～600g/L，即对于总体积为 1L的反应液，需加入10～1000g湿菌体，优选加入200～600g湿菌体。

酵母的利用形式为酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、固定化 细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母或废酵母泥。

其中，有透性的微生物菌株，是指通过化学、物理或生物方法处理细胞从而得到细 胞膜的通透性改变的生产微生物菌株，具体方法为表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、 超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。

表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通 X-100，阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物，或阴离子表面活性剂月桂酰·肌 氨酸盐，表面活性剂使用量为0.01～50g/L，优选1～20g/L，即表面活性剂法处理生产 菌株时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.01～50g， 优选加入1～20g。