[发明专利]一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种稳定诱导人脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

神经系统创伤的修复在临床上仍然是一大亟待解决的难题。作为神经缺损修复黄金标准的自体神经移植存在着来源有限，供区遗留感觉障碍等缺点。

干细胞具有来源丰富，分离培养容易，体外增殖能力强，具有多向分化潜力的特点，近年来已成为组织工程产品种子细胞研究的热点。研究发现，胚胎干细胞(ESCs)，神经干细胞(NSCs)、骨髓基质干细胞(BMSCs)、脐血干细胞等均具有向神经细胞分化的潜能，在移植于动物模型后能改善其神经功能，可作为治疗神经系统疾病的种子细胞。然而，ESCs尚存在定向分化和纯化的技术障碍，且面临众多伦理、法律方面的问题，移植后有形成畸胎瘤的可能，应用受到一定限制。NSCs也受到取材困难、不易获得及伦理、法律方面问题的影响。虽然自体BMSCs在体内或体外均可诱导成为类许旺细胞，自体移植既可解决许旺细胞来源问题，促进神经再生，又符合医学伦理学的规范，但BMSCs细胞采集过程对供者造成痛苦，分离细胞量有限，且随着年龄增长其干细胞数量和增殖能力也显著下降，较难满足临床需要。脐血MSC含量稀少，分离困难，不适合规模化操作，其采集也面临着伦理学的限制。

近来研究表明，人脐带富含间充质干细胞(HUCMSCs)，是一个可能优于骨髓和其它组织的种子细胞源泉，能够克服以上所有的缺陷，具备以下优点：(1)来源充足，取材方便，作为一种分娩废弃物，其采集不存在任何伦理问题；(2)每根脐带的长度在40～60cm，细胞数量丰富，增殖能力强；(3)分离出的MSC免疫表型不成熟，具有较弱的免疫细胞抗原性。(4)HUCMSCs具有与BMSCs相似的干细胞特性，具有良好的自我更新和多向分化增殖能力，因此可在较短的时间内可获得更多的细胞数量，以满足临床需求。研究表明：HUCMSCs在体外可被诱导为神经元样或神经胶质样细胞，移植治疗大鼠脊髓损伤或帕金森病，可在体内微环境内向神经元和星形胶质细胞分化，为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的种子细胞来源。

将干细胞诱导为类神经细胞的传统方法是化学诱导法，即干细胞在各种诱导剂作用下，可表现出神经细胞形态及特异性标志物。但诱导剂可能影响细胞分裂和存活，引起细胞收缩并提高细胞对抗体的免疫活性，是否能用于临床还需要进一步的实验证实。近来发现，将体细胞与干细胞共培养，通过体细胞分泌的营养因子等因素，可诱导干细胞定向分化，是一项较简便经济的方法。将大鼠许旺细胞与大鼠BMSCs或人胚胎神经嵴细胞共培养，发现上述两种干细胞均可表达Nestin，GFAP等神经细胞表面标志。这些实验为将HUCMSCs向许旺细胞定向分化提供了新方法。至今为止，尚未有将HUCMSCs通过化学或共培养的方法诱导为类神经细胞，并应用于神经损伤修复研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法。

本发明提供了一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，该方法包括：

(1)将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0.4μm孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培养液为许旺细胞培养液；

(2)每三天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。

所用的干细胞通常为脐带间充质干细胞，两周时间可以是10-15天。

所述的隔离共培养是小室内放置许旺细胞，下层培养板放置脐带间充质干细胞。

所述的隔离共培养也可以是小室内放置脐带间充质干细胞，下层培养板放置许旺细胞。

所用的培养液中含有福司柯林和神经生长因子。其中，福司柯林的浓度通常是2-14μm，神经生长因子的浓度通常是10-200ng。

所用的脐带间充质干细胞可以取脐带，通过下述方法获得：将脐带从手术台上取下，无菌下浸入DMEM/10％FBS培养基中；PBS充分洗去血液，去除脐静脉及动脉，将脐带剪碎至1mm³大小组织块，移至0.1％复合胶原酶NB4和0.1％透明质酸酶混合液中，37℃持续振荡消化3h，然后加入3倍匀浆量的PBS稀释，继续振荡30分钟后，细胞滤器过滤，离心、重悬、计数。细胞接种于培养皿中，置于37℃，5％CO₂孵育箱培养。培养48h后更换培养基，去掉未贴壁细胞。以后每2天换液1次，至细胞融合传代。