[发明专利]中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin基因编码蛋白及应用

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EsCystatin)基因的体外重组表达技术及其活性鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin蛋白，该重组蛋白对木瓜蛋白酶具有一定抑制作用，以及在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

背景技术：

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是广泛存在于动植物组织和体液中的蛋白酶抑制剂，它能与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成紧密的复合物，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的二硫键不被半氨酸蛋白酶破坏，阻止蛋白的降解。半胱氨酸蛋白抑制剂是抑制半胱氨酸蛋白酶的一类超家族，根据它们的结构特征可分为三个家族。第一类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族是一类低分子量蛋白，无二硫键；第二类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，也是只有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，至少有两个分子内二硫键，第三类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族是含有多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，每个结构域中的二硫键的位置类似于第二类家族。在脊椎动物中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是抑制半胱氨酸蛋白水解酶的一类蛋白家族，主要是组织蛋白酶家族的强抑制剂。它们可保护和调控内源蛋白水解酶活性。在人类抵抗心血管疾病，脑梗死高血压病、糖尿病、原发性肾病、恶性肿瘤时，出现难以控制蛋白质水解和组织损伤，半胱氨酸蛋白酶抑制剂起到调控和保护的功能。近年来，无脊椎动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂也有零星报道，比如在肝吸虫(Fasciola hepatica)，线虫(Acanthocheilonema viteae)，马来丝虫(Brugia malayi)，盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)，巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)，捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)和马蹄蟹(Trachypleus tridentatus)中的半胱氨酸蛋白酶可参与机体的免疫防御。但是在甲壳动物中还没有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道。

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)属于甲壳动物，是我国重要的水产养殖品种之一。然而，随着养殖规模和养殖条件的恶化，病害发生日益频繁，尤其是病毒、细菌、真菌等微生物引起的传染性疾病，每年均造成巨大的经济损失，严重阻碍了甲壳动物养殖业的发展。因此，开展中华绒螯蟹免疫机制研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，以期通过蟹自身免疫抵抗力的提高来防止和减少蟹病的发生，具有十分重要的理论与实践意义。因此从中华绒螯蟹中克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，并对其体外原核重组表达蛋白的抑制活性进行深入研究，将有助于开发天然的水产药物用于人类疾病的治疗。

发明内容：

本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，为进一步研究中华绒螯蟹防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治，开发医药产品和饲料添加剂奠定应用基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因EsCystatin，具有序列SEQIDNo.1中碱基序列。其是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin的cDNA序列，该序列全长为1486bp，包括开放阅读框363bp，编码120个氨基酸，5’非编码区长为92bp，3’非编码区长为1031bp，有一个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)，和多聚腺苷酸尾巴。利用pEASY-E1表达载体在大肠杆菌中Rosetta-gami表达菌株中重组表达了该蛋白，表达产物对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。木瓜蛋白酶浓度为1μg mL^-1。当重组蛋白浓度达到300μgmL^-1时，接近89％的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组蛋白浓度达到350μg mL^-1时，木瓜蛋白酶活性100％被抑制。

其编码蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，分子量为13.39kDa，等电点为5.48，具有一个半胱氨酸蛋白酶样结构域，没有半胱氨酸残基，没有二硫键。