[发明专利]从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种关于基因克隆的方法。

背景技术

目前，扩增目的基因常用方法有两种：PCR扩增和基因合成。传 统的PCR扩增比较繁琐，因为基因组中含有内含子，以及一些特殊 基因的低拷贝数，加上其他一些不能确定的因素，要从基因组DNA 中直接扩增获得目的基因几乎是不可能的，所以一般都是经过组织 RNA提取，反转录合成cDNA后应用传统的PCR技术扩增出目的基 因。而其中的RNA提取操作过程要求严格，且很容易失败；加上一 些含有目的基因的组织很难得到，所以此种方法有一定的局限性。应 用化学合成的方法虽然可以得到目的基因，但是如果所需基因片段较 长合成费用将会很昂贵。

随着人类基因组计划以及一些真核生物基因组测序的完成，从基 因组数据库查找所需基因的信息已不是难事，利用各种PCR技术扩 增或是合成目的基因也已成为研究热点。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种快速从基因组 DNA中扩增目的基因的方法。

为了实现上述目的，采用以下技术方案：

从基因组DNA中快速扩增目的基因的方法，其包括如下步骤：

①基因组DNA制备；

②设计基因外显子的扩增引物；

③外显子扩增，分别扩增各个外显子；

④基因片段扩增。

进一步的技术方案是，

设计基因外显子的扩增引物的具体过程是，先查到基因的外显子 序列信息，针对每个外显子分别设计重叠引物(设计方式遵从一般引 物设计规则即可)。第一个外显子的反向引物和最后一个外显子的正 向引物分别设计酶切位点。外显子扩增的扩增程序选用touch-down PCR程序。

再进一步的技术方案是，

基因片段扩增的具体过程是，将步骤③中扩增得到的所有外显子 胶回收纯化后等体积混合后作为模板，用第一个外显子的反向引物和 最后一个外显子的正向引物扩增得到目的基因片段，扩增程序选用 touch-down PCR程序。

本发明即是通过一种特殊的引物设计方法，首先从基因组中扩增 出所需的外显子，纯化后混合，再用两端引物，在Touch-down的程 序中扩增出所需的目的基因。这种基因拼接的方法，避免了RNA制 备、反转录合成cDNA的过程，因此可以快速准确的在数小时内完成 基因克隆，同时应用这种方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序 列，且扩增长度不受限制。申请人已利用该技术成功克隆长度1540bp 的人a-葡萄糖苷酶基因片段及长度1365bp的人MICA基因，具体过 程在后续具体实施方式中详述。

附图说明

图1为外显子扩增引物设计原理示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的基因扩增方法作进一步的具体 说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的 范围。

实施例一：人a-葡萄糖苷酶基因片段扩增

1.人基因组DNA的制备：

健康人的血液样本由四医大儿科实验室惠赠，全血基因组DNA 提取试剂盒(溶液型)购自长沙联博志达生物技术公司。基因组DNA 提取方法按照试剂盒说明操作，所得人基因组DNA于-20℃保存备 用。

2.人a-葡萄糖苷酶基因第25到第36个外显子的扩增引物设计：

根据查到的人a-葡萄糖苷酶基因的外显子序列信息 (NM_004668.2)，针对12个外显子分别设计重叠引物，具体操作 如图1所示(仅为原理示意图)：

12个外显子设计引物序列如下表：