[发明专利]一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗

说明书

技术领域

本发明属于涉及生物制药领域。具体而言，本发明涉及一种嗜水气单胞菌口服疫苗。更具体地说，本发明涉及微囊抗原传递系统及基于此开发的嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，该疫苗可用于预防嗜水气单胞菌病引起的出血性败血症。也可将该微囊抗原传递系统应用于鱼类其它病原的口服疫苗的开发。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)可引起鱼类、两栖类和爬行类动物爆发出血性败血症，导致淡水鱼皮肤出血(出血性败血症)和大量死亡，给规模化淡水鱼养殖业带来了巨大经济损失。应用抗生素等传统疗法易诱发细菌耐药，药物残留及环境生态破坏等一系列问题。

目前所开发的嗜水气单胞菌疫苗(全菌疫苗、基因工程疫苗)均为注射免疫或浸泡免疫。虽然与注射免疫、浸泡免疫相比，口服免疫效果较差，但鱼口服免疫具有使用方便、安全好、鱼群应激小、适于规模化及重复免疫等特点，有望成为最有前景的鱼类免疫途径。由于鱼类胃酸性环境及肠内消化酶的破坏，传统疫苗到达肠粘膜之前被大量降解，即使有少量的抗原到达肠粘膜也无法形成持续性的免疫刺激，很难诱发高效的免疫应答，而通过增加免疫剂量或免疫次数来提高免疫效果又大大提高了免疫成本，免疫效果较差。近年来，国内外许多学者先后利用各种聚合物微囊传递系统开展口服疫苗研究。

2006年A.P.Rodrigues等人利用植物油乳化法研制嗜水气单胞菌海藻酸钠口服疫苗，但所制备微球的粒径较大，平均粒径约为50μm，不符合理想微球的粒径要求(10μm左右)，可能会影响抗原提呈细胞对微球的摄取，动物免疫试验效果未见报道。

海藻酸钠(C₆H₇O₈Na)_n是由α-L-甘露糖醛酸(M单元)与β-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1，4-糖苷键连接而组成的线性共聚物。海藻酸钠粉末遇水变湿，可缓慢的完全水化并溶解。海藻酸盐可通过其古罗糖酸的钠离子与二价阳离子(Ca²⁺、Ba²⁺)交换而瞬时凝胶化成球。壳聚糖是通过甲壳素脱乙酰化制备的天然高分子直链多糖。由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，壳聚糖和海藻酸钠可以通过正、负电荷吸引形成聚电解质膜。微囊抗原传递系统应具有保护抗原的免疫原性及促进抗原提呈细胞对抗原的摄取的作用。海藻酸钙微球对酸性环境具有抵抗性，而壳聚糖对碱性环境具有抵抗性。两者形成的微囊对抗原的保护性较好，但如何调整微囊的粒径，使其更易被抗原提呈细胞所捕获，以及如何控制微囊对抗原的缓释等问题成为本研究的焦点与难点。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于开发一种在鱼类消化系统中相对稳定，粒径适中，易被巨噬细胞捕获，具有缓释性和抗原保护性，且生物相容性好的微囊抗原传递系统。并将该微囊抗原传递系统应用于嗜水气单胞菌，开发出嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，以克服灭活疫苗直接口服免疫效果差的缺陷。以鲫鱼为模型动物，验证了该口服疫苗的免疫效应。该疫苗可用于鱼类嗜水气单胞菌所引起的出血性败血症的免疫预防。

技术方案

一种嗜水气单胞菌微囊口服疫苗，其中包括海藻酸钙-壳聚糖控释微囊以及包封于所述微囊中的灭活嗜水气单胞菌。包括：

1.1疫苗株的筛选

本发明中所使用的疫苗株为本实验室分离并保存的嗜水气单胞菌J-1株。J-1株，属嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.3220。

1.2灭活全菌菌液的制备

将嗜水气单胞菌J-1株复壮后于28℃下扩大培养，经0.4％的福尔马林灭活后，用pH

7.2的PBS液洗涤细菌，将细菌浓度调整为1.0×10¹⁰cfu/mL。

1.3嗜水气单胞菌海藻酸钙-壳聚糖微囊(Ah-ACMS)口服疫苗的制备