[发明专利]LRRC55基因甲基化定量检测方法

权利要求书

1.一种LRRC55基因甲基化定量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A、待检样本处理：用QIAGEN EpiTect Bisufite Kit^TM试剂盒对待检样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；

B、分别制备ACTB参照基因的标准品和LRRC55靶基因的标准品：

设计并合成ACTB参照基因的BSP引物：

ACTB BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′

ACTB BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′

设计并合成LRRC55靶基因的MSP引物：

LRRC 55BF：5′GGTTTAGAAAAATGAGTTTG′3′

LRRC55BR：5′CCTTCATCCCAACATCCCTT 3′

ACTB参照基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；

LRRC55靶基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.57.75℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；

PCR产物进行纯化，连接入pMD18-T Vector，然后电击法转化至E.coliDH5α、工程菌，测序正确的重组菌进行扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和LRRC55靶基因的标准品；

C、在BSP扩增片段内设计MSP引物及探针

LRRC 55MF：5’GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC 3’

LRRC55MR：5’AAAAAAACCGAAAATAATACCACG  3’

D、LRRC55基因甲基化的定量检测：

设计并合成ACTB的探针和LRRC55的探针：

ACTB探针：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB

LRRC55探针：FAM-ATAGTAGGTGGGTAAGGG-MGB

对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR、条件是：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环；检测ACTB和LRRC55基因的拷贝数；待检样本DNA中LRRC55基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中LRRC55基因甲基化程度的定量值。

2.根据权利要求1所述的一种LRRC55基因甲基化定量检测方法，其特征在于其中的待检样本包括活检组织、穿刺液积细胞、尿液、粪便、外周全血、外周血清/浆、胰液。